研究背景:目前,疫苗接种仍然是控制和预防传染病的最具成本效益的手段。重组亚单位疫苗具有安全和高效的优点,因而被人们广泛接受。但是重组蛋白疫苗无法引起足够强的免疫应答,需要疫苗佐剂来增强抗原的免疫活性,以达到预期的免疫效果。目前,国外批准上市的人用疫苗佐剂有限,主要包括铝佐剂、MF59佐剂和AS系列佐剂等,而中国到目前为止只有铝佐剂被广泛应用于疫苗研发生产。铝佐剂是使用时间最长的人用疫苗佐剂,但诱导细胞免疫应答能力弱。大多数疫苗尤其是肿瘤疫苗迫切需要在免疫抑制的肿瘤微环境中能够引起有效细胞免疫应答的新型佐剂。因此,寻找可增强抗原产生高效的体液和细胞免疫应答的新型疫苗佐剂是研究者的目标。皂苷类产物以其生物可降解性和来源广泛等优点获得越来越多研究者的青睐,主要集中在皂树皂苷(QS-21)、麦冬皂苷和人参皂苷等。这些皂苷作为佐剂时可增强细胞吞噬,刺激免疫细胞产生细胞因子,激活淋巴细胞环磷酸腺苷-蛋白激酶A(c AMP/PKA)信号通路来增强疫苗细胞和体液免疫应答。如QS-21通过作用于抗原呈递细胞和T细胞,诱导平衡的Th1/Th2免疫应答。以QS-21为核心成分的AS01、AS02和Matrix-M复合佐剂可促进树突状细胞对抗原的交叉递呈,诱导炎症小体产生强烈的体液免疫应答。尽管QS-21在疫苗临床试验中具有独特的效力和前景,但其在稀缺性、异质性、剂量限制性毒性和化学不稳定性方面的固有缺点阻碍了其向社会的应用。因此,开发能够克服(或部分克服)QS-21缺点的新型天然来源皂苷佐剂具有极大意义。麦冬皂苷来源于百合科植物麦冬,是一种三萜类皂苷,前期研究发现其具有促进细胞增殖、抑菌及抗肿瘤等生物活性,但是其作为疫苗佐剂未见报道。我们团队发现麦冬皂苷D(OPD)有较好的佐剂活性,具有增强细胞和体液免疫应答能力的特点。但OPD的水溶性较差(<20μg/m L),需要额外的技术手段才能有效负载抗原发挥佐剂活性。研究表明,基于纳米的给药系统(NDDS)可应用于负载抗原蛋白,并表现出淋巴细胞Navitoclax体内实验剂量靶向性、肿瘤微环境反应和特定部位释放等突出特性,是疫苗抗原及佐剂的理想递送系统。其中自纳米乳化给药系统是油、表面活性剂和助表面活性剂的混合物,具有良好的生物相容性、高度热力学稳定、高蛋白负荷能力和易于制备等优点,在疫苗中有较多应用。它不仅可以提高疫苗佐剂的溶解度和抗原的生物利用度,还可以增加给药后抗原递送到树突状细胞的准确性。因此,本课题以我们团队前期研究得到的具有佐剂活性的OPD为基础,利用自纳米乳化技术,制备出可以极大提高OPD溶解度、增强疫苗的细胞和体液免疫应答且具有抗肿瘤免疫保护效果的新型麦冬皂苷D自纳米乳佐剂(SND),为研制出国内优良的皂苷类佐剂奠定坚实的实验基础和提供科学的理论依据。研究目的:为了克服OPD的水溶性差、溶血毒性等不足,本课题以我们团队的专利纳米技术与配方为基础,利用低能乳化法制备出溶解度良好、粒径在25-40 nm的SND佐剂。对SND佐剂的外观形态、理化性质、稳定性及体外细胞毒性进行研究后,以鸡卵清白蛋白(OVA)作为模式抗原制备疫苗,开展了其免疫生物学效应研究;并构建稳定的E.G7-OVA细胞C57BL/6小鼠皮下荷瘤模型,观察SND佐剂的预防性及治疗性保护效果,为国内皂苷类佐剂的研发提供实验技术及理论支撑。研究方法:1.SND佐剂的制备及质量特征研究(1)SND佐剂制备方法研究在课题组前期工作基础上,设计并制备以吐温80(Tween-80)为表面活性剂、甘油为助表面活性剂、辛酸癸酸甘油三酯(GTCC)为油相的负载有OPD的水包油型自纳米乳佐剂SNSpectroscopyD,并评价其外在特点以及纳米颗粒的粒径、电位和聚合物分散性指数(PDI)值。(2)SND佐剂的质量特征鉴定方法分别使用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、Nano ZS动态光散射纳米粒度仪、Q600热重-差热同步测定仪、Lambda 950光谱仪、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法、蛋白免疫印迹(WB)法以及噻唑蓝(MTT)比色法检测SND佐剂的粒径、电位、PDI值、结构、失重、稳定性、红外光谱吸收、OVA蛋白在递送系统中的稳定性以及对树突状细胞(DCs)的毒性等质量特征。2.SND佐剂对OVA抗原的免疫增强效应评价分别使用ELISA、ELISpot和grpⅠPanel 23-plex液相悬浮液微阵列芯片技术检测SND佐剂结合模式抗原OVA诱导的小鼠特异性血清抗体水平、血清细胞因子水平、脾细胞分泌细胞因子水平以及脾细胞中OVA特异性的分泌IL-17A和IFN-γ细胞比例等指标。3.SND佐剂对E.G7-OVA肿瘤保护效果及初步机制研究(1)SND佐剂结合OVA抗原皮下接种免疫保护效果评价方法建立稳定的C57BL/6小鼠皮下E.G7-OVA细胞荷瘤(小鼠T淋巴瘤)模型,分别在植瘤前后使用SND佐剂结合OVA抗原皮下接种免疫小鼠,根据小鼠的体重、肿瘤体积、小鼠生存率以及HE染色病理切片来评价其预防性以及治疗性抗肿瘤保护效果。(2)SND佐剂结合OVA抗原皮下接种免疫保护机制研究方法使用小动物活体成像系统(IVIS)检测SND佐剂增强OVA抗原的小鼠皮下滞留时间。研究结果:1.SND佐剂的制备及质量特征研究使用Tween-80、甘油和GTCC利用低能乳化法成功制备出平均粒径为25.27±0.1931nm,平均zeta电位为-12.9±2.17 m V和PDI值为0.274±0.018的SND佐剂,其外观澄清透明,且室温存放28天内质量稳定。通过TEM、SEM和AFM观察发现,SND颗粒大小在25-40 nm左右,表面光滑呈球状,分散性较好。由差示扫描量热(DSC)、热重(TG)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析可知,OPD可成功负载于自纳米乳。SDS-PAGE和WB的检测结果显示蛋白条带整齐、均一且清晰明亮,证实OVA蛋白在OPD、SND和空白自纳米乳(BSN)中稳定。此外,MTT法检测结果证明SND佐剂比OPD佐剂具有更低的树突状细胞毒性和更高的细胞存活率(P<0.05)。2.SND佐剂对OVA抗原的免疫增强效应评价ELISA检测SND佐剂结合OVA抗原对小鼠肌肉接种的免疫效应结果表明,OVA/SND组相比于OVA/OPD组在第35天时可诱导生成更高的IgG(P<0.01)、IgG1(P<0.05)、IgG2a(P<0.05)和IgG2b(P<0.001)血清抗体滴度,以及Th1型细胞因子IFN-γ(P<0.01)和IL-1β(P<0.001)、Th2型细胞因子IL-4(P<0.05)和Th17型细胞因子IL-17A(P<0.001)的表达水平。ELISpot检测结果显示SND佐剂显著提高了脾细胞中OVA特异性的IFN-γ-T(P<0.01)和IL-17A-T(P<0.01)细胞活化比例,提示该佐剂可提高CD8~+辅助性T淋巴细胞和CD4~+辅助性T淋巴细胞的活化能力。通过grpⅠPanel 23-plex液相悬浮液微阵列芯片检测免疫后小鼠体液中辅助性T细胞(Th)亚群产生的23种细胞因子结果表明,SND佐剂可以显著增强OVA特异性的Th1型、Th2型和Th17型免疫应答。具体体现在Th1型细胞因子(IL-1α、IL-2、IL-12p40、IL-13、Eotaxin、KC、MCP-1、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-3、IL-12p70、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、C-GSF和GM-CSF)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和IL-10)和Th17型细胞因子(IL-17A)水平的显著增加。3.SND佐剂对E.G7-OVA肿瘤保护效果及初步机制研究对E.G7-OVA荷瘤小鼠,SND佐剂结合OVA抗原皮下免疫小鼠能够发挥有效的预防性和治疗性抗肿瘤保护效果,可有效抑制肿瘤的生长并延长小鼠的生存时间。对预防性肿瘤组织和治疗性肿瘤组织的HE染色病理切片观察结果显示,OVA/SND组在×100、×200和×400倍时相比于OVA组、OVA/BSN组和OVA/OPD组有大量的炎性细胞浸润,且肿瘤组织生长不紧密。OVA组和OVA/OPD组皮下免疫小鼠后的1 h和24 h内Cy5.0荧光强度几乎完全消失,而用OVA/SND疫苗接种后其荧光强度可维持384 h。IVIS的检测结果表明SND佐剂可以显著延长OVAPevonedistat抗原在小鼠皮下的滞留时间(P<0.01)。研究结论:1.成功制备出具有较好的质量特征、稳定性和低细胞毒性的SND佐剂。2.SND佐剂能够有效地增强OVA抗原的体液和细胞双重免疫应答效果,包括特异性血清抗体的生成、不同类型细胞因子(Th1型、Th2型和Th17型)的分泌、IFN-γ特异性CD8~+T细胞和IL-17A特异性CD4~+T细胞的增殖活化。3.SND佐剂对于E.G7-OVA荷瘤小鼠具有较好的预防和治疗作用,可显著延长小鼠的生存时间。4.SND佐剂可以延迟OVA抗原的释放,并显著延长其在小鼠皮下的滞留时间。