【研究背景】创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是全球创伤相关损伤中致残和瘫痪的主要原因之一。每年有5000万以上的人患有不同程度的创伤性脑损伤。仅在中国,以人口为基础的TBI死亡率约达到每10万人中有13例。在战场条件下,颅脑战伤作为战伤中的重要部分,其阵亡率和伤亡率历年来均占各类型战伤的首位,因此,对脑损伤的基础研究和临床治疗对提升部队战斗力和军人健康水平具有重大意义。铁死亡是由脂质、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和铁的异常代谢引起的一种不同于其他程序性的细胞死亡。目前在帕金森病、脑出血和创伤性脑损伤中被发现是导致中枢神经系统损伤的主要诱因之一。脑内铁积累增加所导致的脂质过氧化、线粒体功能障碍、活性氧增加等都可导致神经元的损伤。神经元是脑中的主要细胞,具有接受、整合、传导和传递信息的功能,它的病理变化主要包括神经元的急性坏死以及中央性尼氏小体的溶解等。认知功能需要依赖于神经元突触之间释放多种神经递质来进行信息传递,而释放神经递质需要触发钙离子通道以及大量能量支持。在创伤性脑损伤急性期,过度的神经炎性反应不利于神经元的存活及修复,进而加重了组织损伤,因此减少铁的过度积累、抑制脂质过氧化、维持线粒体功能稳态和调控急性期的炎症反应成为创伤性脑损伤后神经修复的重要策略。最近几年,骨来源的内分泌因子对机体多种系统的调节功能越来越受到关注。成骨细胞特异性分泌的骨钙素表现出调节全身葡萄糖和能量代谢、生殖和神经认知等功能,脑内激素改变参与突触神经传递基因产物的产生以及脑结构的重塑。骨钙素(Osteocalcin,OCN)是由骨器官分泌的具有重要调控功能的骨源性因子,有完全羧化(Carboxylated)和不完全羧化(Undercarboxylated)两种形式。前者主要沉积于骨基质,而后者则通过循环系统作用于除骨以外的多个器官来发挥调节功能。OCN可以穿过血脑屏障,结合中脑、脑干以及海马来调节单胺类神经递质的水平、维持海马的神经发生并且改善空间学习记忆的障碍。研究报道,母体来源的uc OCN在新生鼠的神经发生和发育过程中起到了非常重要的作用,但是其是否参与成年机体脑创伤后神经修复过程仍然有待探索。因此,本课题首次探究OCN在铁死亡中的作用,研究OCN在创伤性脑损伤中有关神经修复和保护方面的作用机制,为创伤性脑损伤的治疗提供新靶点。【研究目的】(1)明确TBI后OCN在神经损伤中的表达情况;(2)明确TBI后OCN在神经修复调控中的作用;(3)探索TBI后神经修复与创伤局部微环境的相互作用关系及机制。【研究方法】动物实验:建立小鼠创伤性脑损伤动物模型,通过神经行为学实验检测小鼠TBI后的运动平衡与协调能力、焦虑抑郁样情绪以及空间认知学习能力,在创伤后不同时间点留取损伤部位脑组织。利用Western blot检测OCN、Bcl2、NEUN、BDNF、PSD95蛋白以及铁死亡相关蛋白GPX4在不同时间点的表达变化;HE染色和尼氏染色检测神经元结构损伤情况;HE染色检测神经元损伤情况;利用免疫荧光检测不同胶质细胞的活化情况;免疫荧光双重染色检测OCN不同类型神经细胞中共定位情况;q RT-PCR检测炎症因子IL-1β、TNF-α的表达水平。细胞实验:Erastin诱导HT22细胞发生铁死亡,q RT-PCR检测炎症因子IL-1β和TNF-α的表达水平;Western blot检测铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11的蛋白表达变化;CCK-8法检测不同浓度的Erastin对HT22细胞存活率的影响以及OCN的表达变化;si RNA转染实验检测HT22细胞中敲低OCN后铁死亡相关蛋白medical testing的表达变化并通过外源给予uc OCN进行回复实验;通过分子对接预测uc OCN与GPX4之间的相互作用力;利用GPX4 si RNA转染实验观察靶点干扰后uc OCN发挥的效应。【研究结IDN-6556使用方法果】(1)TBI后小鼠损伤部位脑组织OCN表达显著升高TBI术后1、3和7天的损伤部位脑组织OCN蛋白表达水平增高,且在第3天达到高峰并持续到7天。其中,疲劳转棒实验和平衡木测试结果表明,和sham组相比,TBI后小鼠在疲劳转棒的时间降低,通过平衡木时间有所增加,运动协调以及平衡能力均下降;悬尾实验、强迫游泳实验结果表明,TBI后小鼠的不动时间增加,出现了抑郁样行为;旷场实验检测TBI小鼠在旷场中心时间和路程显著降低,出现焦虑样行为;水迷宫实验结果表明TBI后小鼠探索时间明显升高,空间记忆能力下降。q RT-PCR检测TBI后小鼠损伤局部脑组织炎症因子表达水平增加;尼氏染色观察TBI后小鼠损伤局部脑组织神经元细胞凋亡。免疫荧光检测TBI后小鼠损伤局部的星形胶质细胞和小胶质细胞活化。(2)OCN敲除可导致小鼠焦虑抑郁样行为,并影响空间记忆能力构建基因敲除鼠,对同批次WT和OCN~(-/-)小鼠同时进行TBI造模,疲劳转棒实验和平衡木测试结果表明,与WT sham组相比,OCN敲除后并不影响小鼠的运动平衡能力,与WT TBI组相比,OCN~(-/-)TBI组运动平衡和协调能力无显著差异;悬尾实验、强迫游泳实验结果表明,OCN敲除后的小鼠不动时间延长,表明OCN敲除可导致小鼠抑郁样行为,TBI后加重了这种现象;旷场实验结果表明,与WT组相比,OCN敲除后小鼠在旷场中心时间和路程显著降低,出现焦虑样行为。水迷宫实验结果表明,与WT组相比,OCN敲除后影响小鼠的探索时间,空间记忆能力下降,OCN~(-/-)组TBI探索时间最长。NSC 127716说明书(3)神经元是小鼠TBI后OCN在损伤局部脑组织发挥神经修复作用的潜在效应细胞取TBI小鼠脑组织做冰冻切片,免疫荧光染色共定位结果显示,OCN主要在神经元上表达,且与星形胶质细胞特异性蛋白抗体GFAP不存在共定位,小胶质细胞存在部分共定位,说明神经元是小鼠TBI后OCN在损伤局部脑组织发挥神经修复作用的潜在效应细胞。q RT-PCR、Western blot检测小鼠TBI后损伤部位脑组织神经元NEUN、突触后致密蛋白PSD95、神经营养因子BDNF以及铁死亡关键蛋白GPX4在不同时间点的表达变化。(4)OCN敲除后对TBI小鼠损伤局部铁死亡及免疫微环境的影响及相关通路变化免疫荧光检测OCN敲除后不同组小鼠TBI损伤周围脑组织胶质细胞的变化,结果显示,与WT sham组相比较,OCN~(-/-)sham组没有明显的变化,OCN~(-/-)组的小鼠TBI后星形胶质细胞和小胶质细胞活化明显;q RT-PCR检测OCN敲除后TBI后不同组小鼠损伤周围脑组织炎症因子的表达变化,结果显示,与WT sham组相比较,OCN~(-/-)sham组没有明显的变化,与WT TBI组相比,OCN~(-/-)TBI组小鼠TBI损伤周围脑组织炎症因子明显升高;尼氏染色观察OCN敲除后不同组小鼠损伤局部神经元的结构损伤情况,结果显示,与WT组相比较,OCN~(-/-)sham组的尼氏体不均匀分布,受损神经元出现收缩,细胞质染色加深,而OCN~(-/-)TBI组小鼠神经元数目比WT TBI组小鼠显著减低;Western blot检测OCN敲除后的小鼠铁死亡相关蛋白GPX4的表达情况,与WT组相比,OCN~(-/-)sham组GPX4表达降低,OCN~(-/-)TBI组GPX4表达最低,并检测了OCN敲除后小鼠不同组小鼠损伤脑组织相关通路的变化,结果显示,提示OCN可能通过调节Akt-m TOR和Sirt1/PGC1a通路进一步发挥对TBI后神经损伤的保护作用。(5)干扰OCN的表达后加重海马神经元HT22细胞发生铁死亡采用不同浓度Erastin对HT22细胞进行处理,来诱导HT22细胞铁死亡。30μmol/l Erastin作用于HT22细胞24h后细胞贴壁能力下降,间隙变宽,呈现出细胞损伤的形态表现;加入5ng/ml uc OCN后,单层培养细胞中的漂浮细胞明显减少,贴壁性增强,细胞间隙恢复,有效缓解了细胞损伤状态,显示出uc OCN对细胞具有一定保护作用。Western blot实验检测表明,OCN敲低后,与Eratin单独处理组相比,HT22细胞中GPX4和SLC7A11蛋白表达进一步减少,说明细胞内OCN的存在有助于维持神经元细胞内铁死亡关键蛋白的稳定性。接着在敲低OCN并诱导发生铁死亡的细胞模型中再次补充uc OCN进行回复实验,结果显示,给予外源性uc OCN后铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11的表达水平得到恢复,进一步印证了uc OCN对HT22细胞的保护效应。通过Western blot发现,体外实验再次验证OCN缓解HT22细胞发生铁死亡有可能通过调节Akt-m TOR和Sirt1/PGC1a通路实现的。【研究结论】TBI后小鼠损伤部位脑组织OCN表达水平显著升高,OCN敲除可导致小鼠的焦虑与抑郁样行为,并且影响其空间记忆能力;神经元是小鼠TBI后OCN在损伤局部脑组织发挥神经修复作用的潜在效应细胞;OCN敲除后导致TBI小鼠损伤局部免疫微环境炎症因子的升高,加重胶质细胞活化和铁死亡;干扰OCN的表达后进一步导致海马神经元HT22细胞发生更为严重的铁死亡;uc OCN能够部分抑制HT22细胞死亡,这一作用有可能通过调节Akt-m TOR和Sirt1/PGC1a通路介导的。该研究结果不仅明确了OCN对TBI神经损伤中发挥积极调控作用,同时为治疗创伤性脑损伤提供了潜在的干预靶点和治疗策略。