骨骼作为机体的承重器官具有应力敏感性,为了应对外界生物力学负荷的变化,骨组织能够启动靶向骨重建来动态调整自身结构,从而达到最优的状态。机械负荷被认为是骨力学适应的主要驱动因素之一,唯有生理性的适度应力刺激才能有效促进骨量净增加,维持骨微结构、基质矿化水平和自身的承载能力。作为骨骼中丰度最高的细胞,骨细胞(OCY)不仅是骨中核心机械应力感受器,还是骨代谢过程的调控器。OCY生存于骨陷窝-小管系统(LCS)内的间质液体环境中,外界应力刺激形成的压力梯度会驱使流体流动从而在OCY表面产生“放大”的流体剪切力(FSS)。课题组前期研究发现,OCY感受到FSS刺激后,会在胞浆内产生独特的多尖峰钙振荡响应并交由下游的钙振荡解码器进行解译。转录因子NFAT已被证明是对低频钙振荡敏感的解码器,其通过脱磷酸入核的方式行使对下游基因的调控作用。诸多研究已经表明NFAT能够调控成骨(OB)和破骨细胞(OC)的活性和功能,而课题组近期结合WB和免疫荧光实验揭示了在OCY中由NFATc3亚型充当钙振荡最核心的解码器,然而,国内外目前尚未有相关研究系统描述NFATc3在骨骼力学信号转导过程中发挥的作用。综上,本研究拟通过使用OCY特异性NFATc3基因敲除小鼠模型,结合体内-原位实验研究正常和NFATc3基因敲除小鼠在生理性应力加载和模拟微重力环境作用下的骨表型及骨代谢变化。而后通过对提取的不同组原代OCY体外施加FSS刺激,探究有无NFATc3基因对体外OCY钙信号响应、生物活性以及细胞因子表达的影响。本研究为系统阐释骨骼是如何解码和转导外界应力刺激这一重要科学问题提供了理论和实验依据,丰富了对不同力学环境下骨力学适应机制和力学信号转导的认识,同时还能为更多以OCY为靶细胞的骨骼疾病提供重要参考,有望产生较高的经济和社会效益。整个研究主要分为三个部分:第一部分:正常应力环境下NFATc3基因敲除小鼠骨力学敏感性研究背景:机械更多刺激是骨代谢的重要调节因子,高于最低有效载荷阈值的适度应力刺激能够通过剂量依赖的骨形成反应促进骨量及骨质量提升。NFATc3亚型已被筛选出是OCY中最核心的解码器,阐明正常应力环境下NFATc3在骨应力适应和骨内稳态调节方面发挥的作用,探讨其潜在机制具有重要科学意义。方法:首先购买了利用Cre-LoxP位点特异性重组酶系统建立的OCY特异性NFATc3基因敲除小鼠模型,使用鼠尾鉴定和NFATc3免疫组化染色对小鼠基因型和敲除效率进行验证。接着使用小动物长骨应力加载装置对正常组(WT组)和基因敲除组(NFATc3-cKO组)小鼠的右侧胫骨施加为期2周的生理性轴向压缩负荷,左侧胫骨作为对照侧。然后采用Micro-CT扫描、免疫荧光双标、甲苯胺蓝染色、Trap染色、H&E染色和免疫组织化学染色的手段分析两组小鼠胫骨的骨表型和骨重塑相关指标。最后提取两组小鼠胫骨,采集分析动态荷载时原位OCY的实时钙响应。结果:所购买的敲除小鼠的基因型均为含Cre酶的flox纯合子,且NFATc3-cKO组小鼠胫骨中OCY的NFATc3阳性率显著降低,证明了基因敲除小鼠用于后续实验研究的可靠性。体内实验结果表明,生理性轴向周期载荷能够显著改善WT组小鼠加载侧胫骨小梁骨的骨量及骨微结构、增加胫骨中段皮质骨厚度、提升OB数量和骨形成率、抑制OC形成、减少非典型性OCY数目。此外,WT组小鼠加载侧胫骨中Sclerostin和RANKL的表达显著下调,OPG的表达显著上调,从而显著促进了OB进行骨合成代谢,抑制OC行使骨吸收功能。然而,生理性压缩载荷刺激却未能使NFATc3-cKO组小鼠加载侧胫骨的骨表型、骨代谢、OCY生物活性及调控功能产生具有统计学差异上的改变。有趣的是,两组小鼠胫骨原位OCY在接受压缩载荷刺激时均会出现明显的多个钙振荡尖峰,且相关钙信号参数之间均不存在统计学差异。结论:NFATc3基因的特异性敲除不会影响上游OCY编码钙振荡的能力,但由于NFATc3可脱磷酸化入核含量的显著降低,会在下游抵消生理性应力加载带来的积极效应,表明NFATc3-cKO组小鼠的应力敏感性显著衰退,力学响应能力降低。本部分实验能够丰富人们对于NFATc3转录因子在正常力学环境下解码、转导骨力学信号机制的认识。第二部分:应力不足环境下NFATc3基因敲除小鼠骨力学敏感性研究背景:应力不足环境(如长期卧床、肢体瘫痪、太空飞行)会引发正常骨重塑过程解偶联,使骨吸收增强,进而导致骨量迅速流失和骨质进行性恶化。上一部分实验研究了NFATc3在转导正常力学刺激中的作用,而模拟微重力环境下NFATc3基因的转导作用仍待系统描述,本部分研究能够为进一步解释微重力环境下的骨丢失机制提供新思路。方法:使用尾吊笼对WT和NFATc3-cKO组小鼠进行4周后肢悬吊处理以模拟低重力环境作用,建模结束后取双侧胫骨,系统分析应力不足环境下两组小鼠胫骨骨表型和骨代谢的改变情况,相关评价指标同第一部分研究。结果:与正常重力环境下饲养的小鼠相比,后肢悬吊处理4周后WT组小鼠胫骨近端骨小梁的骨量显著降低,微细结构明显破坏,骨矿化沉积遭到显著抑制,胫骨骨小梁表面OB数目明显减少,胫骨近端OC数目显著增加,OCY空腔率明显升高。免疫组化染色结果表明,Sclerostselleck PLX4032in阳性表达以及RANKL/OPG的比值显著上调,提示骨合成代谢作用被明显抑制,骨吸收活性显著增强。而NFATc3基因的特异性敲除加剧了模拟微重力环境对骨量和骨微结构的损坏效应,能够进一步抑制OB数量提升并促进OC形成。通过进一步降低OCY的存活状态,使其调控OB和OC的能力遭受更大程度的损坏。结论:NFATc3基因的特异性敲除能够加重失重环境作用下骨丢失的程度,骨稳态及骨应力敏感性遭到更严重的损害。本部分实验进一步证明了NFATc3转录因子在转导骨力学信号过程中发挥的重要作用。第三部分:正常应力环境下NFATc3对体外原代OCY力学信号转导及OCY生物活性的影响背景:间质液体流动产生的FSS是骨中力学信号转导的内在驱动力,对骨形成具有正向调控作用。在第一部分实验基础上进一步研究生理水平FSS刺激下NFATc3是如何调节体外OCY生物活性和骨重塑过程,转导OCY所受生物力学信号的具有重要意义。方法:分别提取两组小鼠长骨中的原代OCY后,利用自制的体外FSS加载系统施加2 Pa、持续3 h的生理性FSS,结束后收集各组原代OCY,使用CCK-8、qRT-PCR和WB检测原代OCY的细胞活力及重要细胞因子的表达水平。此外,原代OCY爬片后利用钙探针孵育,采集FSS刺激下体外OCY的钙信号响应。结果:与各自组内相同环境下静置培养3 h的细胞相比,生理性FSS能显著升高Ctrl组原代OCY的细胞活力,但这种上调作用并未在NFATc3-cKO组原代OCY中被观察到。qRT-PCR检测结果表明,在基因表达层面,同Ctrl组原代OCY,体外生理水平FSS刺激也能够显著改变NFATc3-cKO组原代OCY中调控骨重塑相关因子的表达水平,NFATc3基因的特异性敲除并不能抵消FSS加载带来的积极影响。WB检测结果揭示,在蛋白表lower respiratory infection达层面,NFATc3特异性敲除后体外生理水平FSS刺激对原代OCY中部分调控骨重塑的负向细胞因子(RANKL、Dkk1、Sclerostin)表达水平的下调效应会受到显著抑制,进而抵消了FSS加载促进OB活性,抑制OC分化的积极作用。同第一部分实验,两组原代OCY在接受体外FSS刺激后也均能呈现出明显的钙振荡响应。结论:NFATc3基因的条件性敲除能够抵消FSS刺激对OCY生存力的促进作用并在翻译阶段抑制OCY发挥对靶向因子的调控功能,这与第一部分动物体内实验结果保持一致。本部分实验为我们理解FSS刺激引起的OCY生物学响应和转导过程提供了新视角。