马齿苋(Portulaca oleracea L.)为马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本,药食两用。《中国药典》记载马齿苋能清热解毒、凉血止血、止痢。除了具有抗菌、抗炎和抗氧化等多种药理作用外,伊朗传统医药记载马齿苋还可治疗哮喘。临床试验、动物实验及体外实验均证明马齿苋抗哮喘药效确凿,但其抗哮喘药效物质尚不清楚。马齿苋主要含有生物碱、有机酸和多酚,儿茶酚型生物碱是其特征性成分,具有数量多(60个)、结构类型多样的特点。鉴于激动β2-AR缓解支气管痉挛和抗炎是哮喘治疗的两大策略,本课题组前期通过初筛发现马齿苋中多种儿茶酚型生物碱具有不同程度的体外激动β2-AR和抗炎双功能,推测这些生物碱可能是马齿苋抗哮喘药效物质基础。上述成分中1-苄基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(1-benzyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline,BTQ)和 6,7-二羟基-1-异丁基-1,2,3,4-四氢异喹啉(6,7-dihydroxy-1-isobutyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline,ITQ)为β2-AR强激动剂或选择性激动剂,动物实验表明BTQ和ITQ具有舒张豚鼠气管、缓解OVA或LPS诱导的小鼠气道炎症作用,但其抗炎分子机制不明。NF-κB/MAPK信号通路是调控炎症和氧化应激的关键信号通路,与哮喘气道炎症和上皮细胞损伤密切相关。鉴于马齿苋中四氢异喹啉类生物碱BTQ和ITQ具有气管舒张强活性和抗炎双功能的前期发现,本文基于NF-κB/MAPK信号通路进一步在细胞水平上探究了 BTQ和ITQ的抗炎和抗氧化作用及其分子机制。本文研究内容包括以下两方面:一、BTQ和ITQ对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症反应的影响及其机制研究目的:研究BTQ和ITQ对LPS诱导的RAW 2 64.7小鼠巨噬细胞炎症反应的影响及其分子机制。方法:通过比色法或酶联免疫法测定Pidnarulex生产商炎症介质NO、TNF-α和IL-1β的水平,MTT法测定细胞活力,RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2的mRNA水平,免疫印迹分析测定iNOShepatic toxicity、COX-2以及NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白表达水平,免疫荧光法检测NF-κB p65的细胞定位。结果:与LPS诱导的炎性细胞模型组相比,BTQ和ITQ剂量依赖性地显著抑制NO的产生,其EC50值分别为67.91和80.40μM;BTQ和ITQ(50～100μM)可显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2的mRNA和蛋白表达;BTQ和ITQ(100 μM)均可明显提高NF-κB抑制蛋白IκBα的水平,显著抑制IκBα和p65的磷酸化,减少NF-κBp65的核易位。此外BTQ和ITQ(25～100μM)可显著抑制MAPK信号通路中JNK磷酸化,BTQ还能显著降低p38 MAPK的磷酸化水平,但二者对ERK的活化无影响;结论:本研究首次阐明了 BTQ和ITQ对LPS诱导的小鼠RAW 264.7巨噬细胞炎症反应具有抑制作用,其抗炎分子机制与抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活有关。二、BTQ和ITQ对亚砷酸钠诱导Beas-2B人肺上皮细胞氧化损伤的影PLX5622响及其机制研究目的:研究BTQ和ITQ对亚砷酸钠诱导Beas-2B人肺上皮细胞氧化损伤的保护作用及其分子机制。方法:通过比色法测定化合物对DPPH·和·OH的体外清除活性、GSH含量及CAT和T-SOD的活力,MTT法测定细胞存活率,免疫印迹分析测定MAPK信号通路蛋白表达。结果:BTQ清除DPPH.(EC50=34.20μM)的能力略强于ITQ(EC50=53.47 μM),前者活性略弱于VC(EC50=26.94μM);BTQ清除.OH的能力也比ITQ略高,其EC50值分别为447.85和577.17μM,二者活性略弱于VC(EC50=213.59μM)。BTQ在50～100 μM时剂量依赖性地显著提高亚砷酸钠损伤的Beas-2B细胞的生存率,而ITQ无保护作用;100μM的BTQ或ITQ不仅可显著提高正常Beas-2B细胞中GSH含量及T-SOD活力,还可显著提高亚砷酸钠损伤的Beas-2B细胞中GSH含量、CAT和T-SOD的活力,缓解亚砷酸钠引起的Beas-2B细胞氧化应激损伤;100μM的BTQ可以显著抑制亚砷酸钠损伤细胞中JNK和ERK的磷酸化,但对p38 MAPK的磷酸化无显著抑制作用。而100 μM的ITQ仅下调ERK的磷酸化水平,对JNK和p38 MAPK的磷酸化水平均无作用。结论:首次发现BTQ通过抑制氧化应激以及MAPK信号通路中JNK和ERK的磷酸化,在亚砷酸钠损伤的Beas-2B细胞中发挥保护作用。综上所述,BTQ和ITQ通过调控NF-κB/MAPK信号通路,缓解了 LPS诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞中炎症反应和亚砷酸钠诱导的Beas-2B人肺上皮细胞氧化应激损伤。论文研究结果为阐明马齿苋的平喘物质及其抗炎和抗氧化机制提供了科学依据。