目的:艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染引起的一种广泛传播且无法治愈的疾病,可逐渐破坏宿主的免疫系统。随着新型抗逆转录病毒药物的不断开发,抗逆转录病毒疗法(ART)可将艾滋病患者血浆病毒载量抑制到无法检测的水平,极大地降低了艾滋病相关的发病率和死亡率。但是,由于病毒储存库的存在,中Ipatasertib供应商断抗逆转录病毒治疗可导致病毒载量迅速反弹,因此患者需要终生服药。同时,这将会引起耐药性的问题。ART的主要靶点是HIV-1编码蛋白中的三种酶:逆转录酶、整合酶和蛋白酶,目前流行的耐药毒株上的耐药位点也主要位于这三种酶的基因编码区。基于此,寻找具有治疗STM2457抑制剂潜力的新靶标,特别是那些HIV-1特有,且在其生命周期中起到重要作用的酶或蛋白,针对其研发与现有药物具有不同机制的新型药物来丰富临床治疗手段,是解决目前耐药问题的最佳途径。HIV-1 Tat(transactivator of transcription)蛋白是逆转录病毒特有,由病毒基因编码的HIV-1转录调控蛋白,一般由86-102个氨基酸组成,可反式激活HIV-1的5’长末端重复序列(LTR)上的转录启动子,开启病毒转录,对病毒的感染、复制和再cognitive biomarkers激活起到至关重要的作用。此外,Tat蛋白在病毒感染细胞后最先被合成。即使在未感染细胞中,Tat蛋白也可以通过旁分泌的方式反式激活基因,导致HIV-1感染,而阻断Tat蛋白的功能,就能在极大程度上抑制HIV-1的复制,同时因其只激活病毒特有的转录启动子,对宿主细胞的影响很小。因此,寻找一种新型的Tat蛋白抑制剂具有重要的学术价值和潜在的临床意义。本研究试图从化合物库中筛选出可以特异性抑制Tat蛋白的化合物,进而抑制HIV-1复制,为艾滋病的治疗和预防提供新思路。方法:首先,本研究利用稳定表达的B亚型和CRF01＿AE重组型Tat蛋白的单克隆细胞株建立靶向Tat蛋白的HIV转录调控因子高通量筛选平台,并对其进行稳定性验证。利用该平台,从包含4208个小分子化合物的多样性母核库中筛选出对B亚型和CRF01＿AE重组型的Tat-LTR有调控作用的小分子化合物,通过细胞ATP活性检测实验验证筛选出的调控因子备选物的细胞毒性。其次,使用HIV-1 B亚型毒株NL4-3和CRF01＿AE重组型毒株GX002体外感染MT2细胞,将筛选出的调控因子备选物作用于体外病毒培养体系,通过ELISA和q RT-PCR检测病毒培养上清液中的P24含量和病毒载量,验证WAY-297131和WAY-235035是否可以抑制Tat介导的HIV-1复制。并将不同浓度的化合物作用于染毒细胞,于病毒感染48h后将培养上清液转入稳定转染有LTR-荧光素酶报告基因的TZM-BL细胞,以荧光值为指标绘制化合物对病毒抑制效果的剂量反应曲线,并计算药物对病毒50%抑制活性(IC_(50))与治疗指数(TI=TC_(50)/EC_(50)),以进一步检测调控因子备选物的抗病毒效果。最后,针对筛选出的备选物,我们还通过免疫印迹实验、分子对接、生物膜干涉技术、蛋白酶和溶酶体抑制剂抑制效果检测实验等方法,深入探究调控因子备选物抑制Tat介导的HIV-1转录激活的作用机制。结果:本研究通过高通量筛选平台,对小分子化合物精选母核库进行筛选工作,我们从4208个化合物中筛选到了两种小分子化合物:WAY-297131和WAY-235035可有效抑制HIV-1复制。具体结果如下:1.WAY-297131和WAY-235035以剂量依赖性的方式抑制B亚型和CRF01＿AE重组型Tat蛋白的功能,但它们对B亚型和CRF01＿AE重组型LTR无抑制作用,且在实验浓度条件下不具备细胞毒性。2.体外病毒感染实验显示,WAY-297131和WAY-235035以剂量依赖性的方式抑制Tat介导的HIV-1 B亚型毒株NL4-3和CRF01＿AE重组型毒株GX002的复制。WAY-297131对NL4-3和GX002的IC_(50)分别为0.0799μM和0.0099μM;WAY-235035对NL4-3和GX002的IC_(50)分别为6.573μM和0.0082μM。3.分子对接分析显示WAY-297131和WAY-235035与B亚型和CRF01＿AE重组型Tat蛋白具有明确的结合位点及较低的结合能,说明它们极有可能具有较高的结合能力。4.亲和力实验表明WAY-297131和WAY-235035均可结合Tat蛋白,通过降低Tat蛋白与LTR的亲和力,抑制HIV-1复制。5.蛋白酶体和溶酶体抑制剂抑制效果实验表明WAY-297131和WAY-235035还可通过蛋白酶体途径促进B亚型和CRF01＿AE重组型Tat蛋白的降解,这可能也是其抑制HIV-1复制的机制之一。结论:本研究筛选出两个抗HIV-1病毒小分子化合物WAY-297131和WAY-235035。它们可直接作用于HIV-1 Tat蛋白,降低其与LTR的亲和力,同时通过蛋白酶体途径促进Tat蛋白的降解,以此来抑制HIV-1的复制,且体外实验显示其IC_(50)较低,已接近FDA批准的抗HIV药物的IC_(50),是很有前景的抗HIV-1感染的候选药物。