卡培他滨为基础的三联药物(卡培他滨+奥沙利铂+亚叶酸)是治疗肠癌肝转移的一线药物,但其毒副作用大,且易耐药,急需发展高效低毒的新药。基于双硫仑(DSF)联合铜离子具有抗肿瘤的潜力,本论文采用白蛋白(BSA)包载铜掺杂介孔硅(MSNs-Cu)为载体,负载DSF,研究其对肠癌肝转移的抑制作用。主要研究结果如下:1、DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒制备及其工艺优化:首先通过硬模板法制备球状二氧化硅,然后采用去模板的方法得到介孔硅,通过单因素法优化后得到的结果如下:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的量0.5 g,三乙醇胺(TEA)的量为0.06 g,硅酸四乙酯(TEOS)的量为1.5 m L,温度为80℃。经过后续铜掺杂、连接白蛋白等所有步骤制备的DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒的最终粒径为160.8±20.7 nm,电位为-22.6±4.5 m V。2、DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒的表征:(1)Cu-MSNs-NH2的红外谱图中,3457 cm~(-1)处有-NH2的伸缩振动峰,并且在1653,1541cm~(-1)处有两个NH2的弯曲振动峰,证明NH2成功连接在介孔硅上。通过高效液相色谱法得到了DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒的载药量和包封率分别为:12.69%±2.47%,44.58%±1.32%。(2)扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)测得介孔硅和铜掺杂介孔硅排列紧密,呈现出圆球形态,并具有介孔结构。(3)X射线电子能谱(XPS)和能谱(EDS)测得介孔硅表面含铜量为4.74%。稳定性实验证明DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒在24 h能保持稳定,粒径和电位在160-180 nm、20-30 m V范围内。(4)BET测得Cu-MSNs的比表面积为670.28 m~2/g,孔径为5.77 nm。(5)体外释放量实验证明了DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒在48 h释放量为27.2±4.1%,72 h为48.7±5.1%,说明纳米粒能缓慢释放药物。结果表明制备的DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒能够对包载的药物进行缓释。3、强力霉素(DOX)联合DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒体外抑制CT26.WT细胞实验:(1)通过MTT法探究DOX联合DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒对肠癌细胞的体外抑制活性,给药48 h后,DOX、DSF、DSF@Cu/MSNs-BSA、DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA、5-氟尿嘧啶组的IC_(50)值分别为37.98、30.82、13.05、6.82/17.14(DSF@Cu/MSNs-BSA/DOX)、25.92μM,72 h的IC_(50)值分别为18.88、8.57、6.02、2.38/5.95(DSF@Cu/MSNs-BSA/DOX)、8.52μM,在DOX、DSF@Cu/MSNs-BSA、DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA加入N-乙酰半胱胺酸之后48h的IC_(50)值为45.55、18.28、7.34/18.34μM(DSF@Cu/MSNs-BSA/DOX),72 h的IC_(50)值为21.66、8.18、4.45/11.13μM(DSF@Cu/MSNs-BSA/DOX),据此结果推测DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA对CT26.WT细胞具有较强的抑制能力,并且抑制能力与产生活性氧有关。(2)高内涵和流式细胞仪测定CT26.WT细胞对Cu-MSNs、DSF-Cu-MSNs和DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒的摄取情况,测得荧光强度分别为1200±102、1454±155、5009±selleck化学214(高内涵);50443.1±1022.1、37295.2±898.2、29082.2±679.3(流式)(n=3,P<0.01),据此推断BSA能增加CT26.WT对药物的摄取。高内涵成像测定DOX、DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒和DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒使CT26.WT细胞产生活性氧情况,测得荧光强度分别为1306±182、3090±272、3927±387,说明药物抑制CT26.WT细胞与活性氧有关。流式细胞仪评估线粒体膜电位,DOX和DSF@Cu/MSNs-BSA能导致线粒体膜电位的下降和丢失,异常细胞占比分别为61.84%、53.77%。(3)利用Pubchem、Swiss Target Prediction筛选DOX和DSF的体内活性成分的作用靶点,结果显示双硫仑的体内分解的活性成分二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)能与碳酸酐酶家族结合,DOX可能与MCL1和PIK3CA进行结合。(4)利用Pubchem、PDB蛋白数据库、Ahttps://www.selleck.cn/products/valemetostat-ds-3201.htmlutoduck Vina进行分子对接,结果显示DDC与CA9和CA12对接的结合能均小于0;DOX与MCL1和PIK3CA对接的结合能均小于0,说明药物的活性成分可以和筛选出的靶点进行结合。4、DOX联合DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒抑制肠癌肝转移的体内活性研究:(1)DOX联合DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒组的小鼠体重在第5天开始上升,而DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒组的小鼠在第8天才上升,推测DOX联合DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒能降低毒性。(2)阴性对照组、DOX组、DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组、DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组和卡培他滨组的平均生存时间为(18.33±1.37 d)、(22.50±1.87 d)、(24.17±1.17d)、(27.67±1.75 d)、(28.00±1.78 d),结果表明DOImmediate accessX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组相较于卡培他滨组抗肠癌肝转移活性上无显著差异(n=6,P>0.05)。(3)DOX组、DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组、DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组和卡培他滨组的肿瘤抑制率分别为15.02%、21.38%、39.30%、36.99%,DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组的抑制率相较于单一给药组(DOX组,DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组)具有显著性差异(n=6,P<0.01),通过金氏公式得到q=1.18,表明二者具有协同效应。(4)观察各组药物小鼠的肝脏标本,DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒组的肿瘤结节最少,说明DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒抗肠癌肝转移作用较强(n=6,P<0.01)。HE染色病理切片表明DOX联合DSF@Cu/MSNs-BSA纳米粒能降低纳米粒的毒性以及增强其对肿瘤细胞的抑制作用。综上所述,推测DOX联合DSF@Cu-MSNs-BSA纳米粒具有高效低毒的特点,具有成为抗肠癌肝转移二线药物的潜力,值得更深入的研究。