目的:设计并构建一种负载小檗碱(Berberine,BRB)的金纳米团簇(Gold nanoclusters,Au NCs),制备BRB-Au NCs,并进一步开展体内外实验探究BRB-Au NCs调控脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后炎症反应,抑制神经细胞凋亡的分子机制,为SCI的治疗提供新的策略和思路,并提供一种利用Au NCs提高药物利用率的新途径,为BRB应用临床治疗SCI提供理论依据。材料与方法:1.论文一负载BRB的Au NCs的制备与表征,利用牛血清白蛋白(BSA)作获悉更多为还原剂和保护剂制备Au NCs,将Au NCs与BRB混合制备负载BRB的Au NCs(BRB-Au NCs)。通过高效液相色谱测量并计算包封率(encapsulation efficiency,EE)和载药率(load capacity,LC),通过透射电镜观察Au NCs的形态和尺寸,通过激光粒度分析仪测量BRB、Au NCs和BRB-Au NCs在不同p H(5.5、6.8、7.4)条件下的Zeta电位,通过紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计测试了BRB、Au NCs和BRB-Au NCs的光学特性,通过高效液相色谱测量BRB-Au NCs的药物释放特性。用Allen法建立SCI模型,实验动物分为两组:BRB组、BRB-Au NCs组,经尾静脉注射BRB或BRB-Au NCs,注射药物24小时后取出脊髓,心脏,肝脏,脾、肺和肾,通过高效液相色谱测量BRB和BRB-Au NCs的体内分布。2.论文二体外培养RAW 264.7细胞,利用MTT法测定不同浓度(0、1、10、50、100和500μM)的BRB和BRB-Au NCs对细胞活力的影响。利用脂多糖(LPS)诱导细胞炎症反应,细胞被随机分为五组:正常对照组;LPS处理组;LPS+Au NCs组;LPS+BRB组;LPS+BRB-Au NCs组。LPS诱导24小时后分别给予50μΜBRB或者50μΜBRB-Au NCs,通过Western blot检测炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。用Allen法建立大鼠SCI模型,实验动物被随机分为四组:假手术组;SCI+生理盐水组;SCI+BRB组;SCI+BRB-Au NCs组。SCI 3天后,提取脊髓蛋白组织,通过Western blot检测炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。3.论文三体外培养VSC 4.1细胞,利用MTT法测定不同浓度(0、1、10、50、100和500μM)的BRB和BRB-Au NCs对细胞活力的影响。LPS诱导细胞炎症反应,细胞被随机分为五组:正常对照组;LPS处理组;LPS+Au NCs组;LPS+BRB组;LPS+BRB-Au NCs组。LPS诱导24小时后分别给予50μΜBRB或者50μΜBRB-Au NCs,通过Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。通过免疫荧光染色检测各组细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3的表达。用Allen法建立大鼠SCI模型,实验动物被随机分为四组:假手术组;SCI+生理盐水组;SCI+BRB组;SCI+BRB-Au NCs组,SCI 3天后,提取脊髓蛋白组织,通过Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。通过BBB评分(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)和斜板试验观察SCI后1、3、7、14、21和28天后大鼠的运动功能恢复情况,通过HE染色观察SCI 28天后损伤区域的组织形态学恢复情况,通过尼氏染色观察SCI 28天后脊髓前角运动神经元尼氏小体的表达情况,并计算尼氏小体的数量,通过免疫荧光染色观察SCI 3天后脊髓前角运动神经元凋亡蛋白Cleaved Caspase-3的表达情况。4.论文四体外培养RAW 264.7细胞,LPS诱导细胞炎症反应,细胞被随机分为五组:正常对照组;LPS处理组;LPS+Au NCs组;LPS+BRB组;LPS+BRB-Au NCs组。LPS诱导24小时后分别给予50μΜBRB或者50μΜBRB-Au NCs,通过Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白tGefitinib-based PROTAC 3分子量-NF-κB、p-NF-κB、IKKβ和NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1、IL-1β的表达以及M1标志蛋白CD86和M2标志蛋白CD206的表达,通过免疫荧光染色检测各组细胞p-NF-κB、NLRP3、CD86和CD206的表达。通过Allen法建立大鼠SCI模型,实验动物被随机分为四组:假手术组;SCI+生理盐水组;SCI+BRB组;SCI+BRB-Au NCs组,SCI 3天后通过Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白t-NF-κB、p-NF-κB、IKKβ和NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1、IL-1β的表达,通过免疫荧光染色观察损伤区域小胶质细胞标志蛋白CD11b的表达,通过HE染色观察BRB-Au NCs对注射过药物的大鼠体内各脏器的毒性。结果:论文一1.使用透射电镜观察到BSA-AuNCs是平均大小约为2 nm的小团簇。同时,Nano Measure 1.2对Au NCs和BRB-Au NCs的动态尺寸的测量和统计结果显示,Au NCs的动态尺寸为1.573±0.57 nm,而BRB-Au NCs的动态尺寸为121.982±20.913 nm。显然,加入BRB后尺寸显著增加,表明BRB和Au NCs团聚体存在共轭关系,材料顺利合成。另外,通过观察溶解在BSA中的BRB和BRB-Au NCs,可以看到BRB在BSA中没有完全溶解,存在悬浮颗粒,静置1小时后,颗粒沉降变为沉淀物。经Au NCs修饰的BRB,在BSA中几乎完全溶解,静置1小时后也没有沉淀形成,间接说明Au NCs提高了BRB的溶解度。2.紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计测量结果显示BRB-Au NCs结合了BRB和Au NCs两者的光学特性,Au NCs与BRB结合后,峰值有了明显的移动,表明Au NCs可能与BRB相互作用,BRB被成功负载到Au NCs。3.Zeta电位结果显示,不像BRB和Au NCs只有一个Zeta电位峰,BRB-Au NCs有多个峰值,导致不同峰值位置之间的平均电位转换。值得注意的是,在不同的p H环境下(即5.5、6.8和7.4),BRB-Au NCs的主要Zeta电位峰可以从负电荷切换到正电荷,说明BRB-Au NCs表现为两性离子药物。正电荷有利于药物与带负电荷的细胞相互作用,而负电荷可以保护细胞免受过度损伤。4.高效液相色谱的测量和计算结果显示BRB-Au NCs的包封率=64.10±1.69%,载药率=8.28±0.28%,说明合成的BRB-Au NCs药物利用率较高。在24 h时,BRB-Au NCs的累计释放量药物量达到70.67±3.05%。同时,在大鼠SCI造模给药后,大鼠SCI区BRB分布较多,这证明了BRB-Au NCs显著提高了BRB的吸收率。论文二1.体外培养RAW 264.7细胞,MTT结果显示当BRB和BRB-Au NCs的浓度超过100μM时,细胞活性开始下降,但总体生存率仍在80%以上。当BRB或BRB-Au NCs的浓度较低时细胞活力几乎100%,低浓度的BRB或BRB-Au NCs对RAW 264.7细胞不存在毒性。2.利用LPS诱导炎症模型,结果显示,BRB-AuNCs降低了RAW 264.7细胞炎症相关蛋白TNF-α,IL-1β,IL-6的表达,并且比BRB的抗炎效力更加显著(P＜0.001)。3.体内实验结果显示,在SCI后3天,BRB-Au NCs抑制了损伤区域炎症相关蛋白TNF-α,IL-1β,IL-6的表达,与BRB组相比,BRB-Au NCs组的TNF-α,IL-1β,IL-6的表达水平降低(P＜0.001),说明Au NCs提高了BRB的抗炎效力,并提高了BRB的生物利用度。论文三1.体外培养VSC 4.1细胞,MTT结果显示当BRB和BRB-Au NCs的浓度超过100μM时,细胞活性开始下降,但总体生存率仍在80%以上。当BRB或BRB-Au NCs的浓度较低时细胞活力几乎100%,低浓度的BRB或BRB-Au NCs对VSC 4.1细胞不存在毒性。2.利用LPS诱导炎症模型,Western Blot结果显示,BRB-Au NCs明显降低了VSC 4.1细胞凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax的表达,并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并且比BRB的抗凋亡能力更强(P＜0.001)。免疫荧光染色结果与Western Blot结果一致,具有显著性差异(P＜0.001)。3.体内实验结果显示,从第7天开始,BRB和BRB-Au NCs的运动功能评分明显高于对照组,且BRB-Au NCs组升高的趋势更加明显,说明BRB-Au NCs促进了SCI后运动功能恢复。同时,BRB-Au NCs组的损伤区域的面积明显缩小,并且提高了脊髓前角运动神经元的存活,与BRB组相比,结果有显著性差异(P＜0.001)。4.脊髓切片免疫荧光结果显示,BRB-Au NCs显著抑制了损伤脊髓前角运动运动神经元内凋亡蛋白Cleaved Caspase-3的表达。同时,Western Blot结果显示,BRB和BRB-Au NCs显著抑制大鼠SCI后凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax的表达,而抗凋亡蛋白Bcl-2被激活,并提高了Bax/Bcl-2的比例,并且BRB-Au NCs组的降低趋势比BRB组更加明显,结果有显著性差异(P＜0.001)。这说明BRB-Au NCs能够比BRB更加有效的抑制SCI后神经细胞凋亡。论文四1.通过Weatern Blot检测各组RAW 264.7细胞t-NF-κB、p-NF-κB和IRegulatory toxicologyKKβ蛋白的表达,结果发现,BRB和BRB-Au NCs能够有效抑制NF-κB的磷酸化,于此同时,NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3,ASC,Caspase 1和IL-1β的表达也明显降低,而且BRB-Au NCs引起的降低趋势更加明显,说明BRB-Au NCs通过NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体的激活,并提高了BRB的治疗效率。2.通过Western blot和免疫荧光研究发现,M1标志性蛋白CD86在经LPS刺激的RAW264.7细胞中表达增加,而M2标志性蛋白CD206表达降低,这说明细胞在经LPS刺激后极化为M1促炎细胞,而BRB和BRB-Au NCs可以使CD86降低,并使CD206升高,并且BRB-Au NCs组的改变最为显著。说明BRB-Au NCs通过NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体的激活,进而减少巨噬细胞向M1表型极化,并增加了M2表型的极化,并且提高了BRB的治疗效率。3.BRB-Au NCs有效降低了SCI 3天后NF-κB的磷酸化和IKKβ的表达,同时抑制了NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,说明BRB-Au NCs通过NF-κB信号通路抑制SCI后NLRP3炎症小体的激活,并提高了BRB在体内的生物利用度,使得BRB的抗炎能力进一步增加。4.使用CD11b标记损伤后3天的脊髓组织切片的巨噬细胞/小胶质细胞,发现BRB-Au NCs有效抑制巨噬细胞/小胶质细胞激活,减少其向M1表型极化,并比BRB表现出较好的效果。5.我们对注射过BRB-Au NCs的大鼠的各种器官和组织(心脏、肝,脾,肺和肾)进行HE染色,发现BRB-Au NCs注射后与正常对照组相比不存在脏器损伤,这表明BRB-Au NCs在体内是安全的。结论:1.本研究成功制备了BRB-AuNCs,并显著提高了BRB的吸收率。2.BRB-AuNCs显著抑制SCI后炎症因子的表达,并比BRB的抗炎能力更显著。3.BRB-AuNCs显著抑制SCI后神经细胞凋亡,并促进SCI后运动功能恢复。4.BRB-Au NCs通过NF-κB通路抑制NLRP3炎症小体的激活,进而介导M2巨噬细胞极化发挥抗炎作用,并提高了BRB的生物利用度。