目的:1.确定野菊花内酯在角质形成细Human papillomavirus infection胞中的安全浓度,探讨野菊花内酯对中波紫外线(ultraviolet B,UVB)照射的角质形成细胞是否有光保护作用;2.探讨野菊花内酯是否能促进角质形成细胞的自噬流,以及野菊花内酯预处理是否通过促进自噬流减轻UVB诱导的角质形成细胞死亡;3.探讨野菊花内酯是否通过经典的AMPK/m TOR信号通路促进自噬流,发挥光保护作用。方法:1.确定安全的野菊花内酯浓度:本研究选用人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)为实验研究对象,通过CCK-8法检测细胞活性,确定对HaCaT细胞安全的野菊花内酯浓度;2.野菊花内酯预处理对UVB所致HaCaT细胞光损伤的保护作用:通过CCK-8法检测细胞活性、倒置显微镜观察HaCaT细胞形态和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放实验评估细胞死亡率;3.野菊花内酯对UVB照射HaCaT细胞凋亡的影响:蛋白免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP及两者的活化剪切条带;4.野菊花内酯对细胞自噬流的影响:在自噬流工具药E64d联合pepstatin处理下,蛋白免疫印迹实验检测LC3蛋白的表达情况,吖啶橙染色检测胞内酸性囊泡,m RFP-GFP-LC3腺病毒转染以检测细胞LC3斑点数;5.野菊花内酯增强的自噬流与其光保护作用的关系:Wortmannin预处理或si-ATG5转染阻断细胞自噬,蛋白免疫印迹实验检测LC3蛋白的表达情况;检测Wortmannin预处理或si-ATG5转染阻断细胞自噬对野菊花内酯调节UVBselleck抑制剂照射后HaCaT细胞的LDH释放的影响;6.野菊花内酯对自噬上游AMPK/m TOR信号通路的影响:首先,验证野菊花内酯和m TOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)对自噬流的促进效应是否有叠加作用;Rapamycin为阳性对照,通过蛋白免疫印迹实验检测野菊花内酯对m TOR下游蛋白p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化表达的影响;以及野菊花内酯对AMPK信号通路中AMPK蛋白磷酸化表达的作用。其次,研究AMPK活性抑制剂Compound C预处理或si-AMPK转染抑制AMPK活性后,对野菊花内Colforsin价格酯调控AMPK蛋白磷酸化表达的影响,以及Compound C预处理对野菊花内酯调控p70S6K蛋白磷酸化和LC3-II蛋白表达的影响。最后,检测Compound C预处理或si-AMPK转染对野菊花内酯调节UVB照射后HaCaT细胞的LDH释放的影响。结果:1.6.25μM及以下浓度的野菊花内酯对HaCaT细胞无细胞毒性;2.UVB(50m J/cm~2)照射HaCaT细胞,成功构建HaCaT细胞的急性光损伤模型。野菊花内酯预处理在急性光损伤模型中具有光保护作用,能增加细胞活性,改善细胞形态的变化,减少LDH释放;3.野菊花内酯增加HaCaT细胞自噬流,并且野菊花内酯预处理也增加UVB照射HaCaT细胞后减少的自噬流;Wortmannin预处理或si-ATG5转染均能逆转野菊花内酯对自噬流的诱导作用,改变野菊花内酯对UVB照射HaCaT细胞后LDH释放的抑制效应;4.野菊花内酯能调控AMPK/m TOR途径,野菊花内酯与Rapamycin在自噬诱导作用上无叠加效应,野菊花内酯降低p70S6K和4EBP1蛋白磷酸化的表达和增加AMPK蛋白磷酸化的表达。Compound C预处理或si-AMPK转染均可逆转野菊花内酯对AMPK蛋白磷酸化表达的增加,改变野菊花内酯对UVB照射HaCaT细胞LDH释放的抑制效应;Compound C也能逆转野菊花内酯对自噬流的诱导作用,改变野菊花内酯对p70S6K蛋白磷酸化的抑制效应。结论:1.6.25μM及以下浓度的野菊花内酯对HaCaT细胞是安全的;2.野菊花内酯预处理能减轻UVB照射的HaCaT细胞死亡,但对改善细胞凋亡无明显作用;3.野菊花内酯增加HaCaT细胞的自噬流,野菊花内酯预处理能显著地增加UVB照射HaCaT细胞后下降的自噬流;4.野菊花内酯通过诱导自噬减轻UVB照射HaCaT细胞的死亡率;5.野菊花内酯通过AMPK/m TOR信号通路介导自噬流的增加,调控其对UVB照射HaCaT细胞的光保护效应。