目的:肿瘤微环境是影响结直肠癌术后复发及化疗效果的重要影响因素,提高病人免疫系统对肿瘤的识别及杀伤作用,可改善病人预后,而肿瘤浸润淋巴细胞也会影响免疫疗法的效果。通关藤是一味中药,具有明显的抗肿瘤、保肝、利尿和免疫调节作用,研究表明,通关藤能有效增加机体CD3+、CD8+T淋巴细胞的数量,增强机体的免疫能力,因此,我们通过体内外实验来研究中药制剂通关藤注射液(MTE)是否通过调节肿瘤浸润T细胞发挥抗结直肠癌作用。方法:1.病人结直肠癌组织IHC实验:我们从天津市人民医院收集了共17例通关藤制剂用药前后的病人结直肠癌组织,用石蜡包埋,制作病理切片,最后用IHC检测用药前后病人癌组织中CD3+/CD8+、PD-1/PD-L1、TGF-β1、FOXP3等相关蛋白的表达情况。2.细胞实验:用CCK8检测不同浓度MTE对Jurkat T淋巴细胞以及结肠癌细胞HCT116、Lo Vo细胞的抑制作用。将HCT116、Lo Vo细胞分别与Jurkat T淋巴细胞共培养,并用MTE处理,48h后分别收集细胞及细胞上清,用Western blot检测用药前后HCT116和Lo Vo细胞PD-L1、TGF-β1的表达,以及Jurkat T淋巴细胞PD-1、FOXP3的表达,使用ELISA试剂盒来检测收集的细胞上清中TGF-β1、IL-2、IL-10的含量。用人类XL细胞因子阵列检测MTE处理前后,Jurkat T淋巴细胞分泌的蛋白的变化。3.AOM/DSS小鼠炎癌模型的建立:将50只,4-5周龄的Balb/c雌性小鼠喂养一周适应环境,然后随机分为5组,每组10只。用AOM/DSS构建结直肠癌动物模型。用不同浓度的MTE进行治疗,第一组为正常对照组,即Control组,给小鼠腹腔注射一次与第二组AOM平均体积相同的无菌生理盐水,后续正常喂养直至实验结束,第二组为AOM/DSS+模型组,即Model组,给小鼠腹腔注射一次AOM(10 mg/kg),然后正常喝水7天,之后将水换成2.5%DSS溶液饮用7天,接着正常喝水14天,此为一个周期(7+14天),循环4个周期。第三组为AOM/DSS+低剂量MTE组,简称LD组,AOM/DSS建模方案同第二组,第二周期DSS饮用结束后,固定时间地点用低剂量MTE(5ml/kg)对小鼠进行腹腔注射,隔一天给药1次,循环到第4周期结束。第四组为AOM/DSS+中剂量MTE组,简称MD组,AOM/DSS建模方案同第二组,第二周期DSS饮用结束后,固定时间地点用中剂量MTE(10ml/kg)对小鼠进行腹腔注射,隔一天给药1次,循环到第4周期结束。第五组为AOM/DSS+高剂量MTE组,简称HD组,AOM/DSS建模方案同第二组,第二周期DSS饮用结束后,固定时间地点用高剂量MTE(20ml/kg)对小鼠进行腹腔注射,隔一天给药1次,循环到第4周期结束。实验期间记录小鼠的存活情况,实验结束后,处死所有小鼠,将小鼠肠道分离并解剖,记录肿瘤数量及大小,将小鼠肠道组织用H&E染色以观察病理结构。将小鼠的结直肠组织用IHC染色,检测用药前后肠组织中CD3+、CD8+、PD-L1、PD-1、TGF-β1、FOXP3的表达情况。4.CT26结肠癌荷瘤模型的建立:随机选取情况较好的Balb/c小鼠20只,使用1×10~7个/ml的CT26细胞悬液selleck PEG3000.1ml注射于小鼠左前肢腋下的皮下,4天后(确认已成瘤)将小鼠分为模型组、MTE低剂量组、MTE中剂量组、MTE高剂量组,腹腔注射MTE,隔天注射一次,用药两周。观察不同剂量MTE用药后,结肠癌荷瘤小鼠存活天数,抑瘤率,以及脾指数。将小鼠肿瘤用H&E染色,观察不同组小鼠肿瘤的病理情况,以及MTE对小鼠的肝,肺、肾的影响。用IHC染色法检测用药前后肿瘤组织中CD3+、CD8+、PD-L1、PD-1、TGF-β1、FOXP3的表达情况。结果:1.病人IHC结果显示:通关藤片用药后,病人结直肠癌组织中CD3+,CD8+T淋巴细胞的比例增加,PD-L1的表达减弱,PD-1的表达无明显变化,TGF-β1以及FOXP3的表达均有所下降。2.细胞实验:48h的CCK8结果显示MTE对结肠癌细胞以及Jurkat T淋巴细胞的抑制作用具有浓度依赖性。用Western blot检测共培养细胞的相关蛋白结果显示:MTE能有效减少HCT116和Lo Vo细胞PD-L1和TGF-β1的表达,与结肠癌细胞HCT116和Lo Vo细胞共培养使得Jurkat T淋巴细胞FOXP3的表达增高,加入MTE逆转了这一结果,共培养后,Jurkat T淋巴细胞PD-1的表达无明显变化。ELISA检测结果显示:MTE能降低HCT116和Lo Vo细胞上清中的TGF-β1含量,促进共培养体系中Jurkat T淋巴细胞IL-2的分泌,抑制IL-10的分泌。人类XL细胞因子阵列研究显示,MTE对T细胞具有免疫增强效果。3.AOM/DSS小鼠炎癌模型:(1)MTE影响AOM/DSS结直肠癌小鼠模型生存率,Model组存活率为50%,LD组存活率为70%,MD组存活率为90%,HD组存活率为90%,Control组为100%。(2)MTE影响AOM/DSS结直肠癌小鼠模型腺瘤的发生情况,随着MTE浓度的增加,腺瘤的数量减少,并呈剂量依赖性关系。(3)H&E染色后的结果表明:对照组小鼠的肠组织肠壁薄,上皮和黏膜很完整,有明显的隐窝结构且排列整齐;而Model组肠组织肠壁跟对照组相比明显增厚,黏膜及上皮都存在严重的破坏,隐窝结构受损严重甚至消失,杯状细胞减少甚至消失,癌变细胞大小不一;AOM/DSS+MTE组小鼠肠组织与Model组小鼠比较,肠壁明显变薄,黏膜及上皮也更完整,隐窝结构损伤程度也更低。(4)IHC病理结果显示:小鼠肠道组织中CD3+、CD8+T淋巴细胞的浸润增多,PD-L1的表达减弱,PD-1的表达无明显变化,TGF-β1以及FOXP3的表达均有所下降。4.CT26结肠癌荷瘤模型:(1)不同剂量MTE对肿瘤体积的影响,MTE中、高剂量组小鼠肿瘤体积明显小于模型组(P<0.05),MTE低剂量组的肿瘤体积和模型组相比无明显差别(P>0.05)。(2)随着MTE浓度的增加,对CT26荷瘤小鼠肿瘤的抑制率升高,并呈剂量依赖性关系。MBAY 73-4506浓度TE高剂量组对肿瘤的抑制作用最明显,MTE低剂量组与模型对照组相比无明显差别(P>0.05)。(3)脾指数:与模型组相比,MProgramed cell-death protein 1 (PD-1)TE各剂量用药组的脾指数都有不同程度增加。(4)H&E染色:与模型组相比,MTE各剂量组肿瘤坏死的范围更大,其中低剂量组与模型对照组相比无明显差异(P>0.05),而MTE高剂量组的肿瘤坏死面积显著大于模型组。MTE对小鼠的肝、肺、肾无损伤。(5)IHC结果显示:小鼠MTE用药组肿瘤中CD3+、CD8+T淋巴细胞浸润增多,PD-L1的表达减弱,PD-1的表达无明显变化,TGF-β1以及FOXP3的表达均有所下降。结论:1、通关藤对结直肠癌细胞具有抑制作用,此外,通关藤抑制了癌细胞的免疫逃逸,并减弱了癌细胞促进T_(regs)细胞分化的作用。2、通过对小鼠皮下肿瘤及AOM/DSS结直肠癌模型,以及使用通关藤治疗的结直肠癌病人的肿瘤微环境研究发现,通关藤可以增加肿瘤浸润T细胞的数量,降低肿瘤浸润T_(regs)细胞数量和癌细胞的免疫逃逸能力,提高宿主对肿瘤的免疫应答发挥抑癌作用。