背景糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种由多种原因引起的以慢性高血糖为主Aboveground biomass要特征的全身代谢性疾病。长期代谢紊乱常导致眼睛、肾脏、骨骼、神经、心血管等多系统的损害,其中糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis,DOP)是糖尿病的常见且严重并发症之一。至今,造成DOP骨代谢异常的机理尚未完全阐明,目前已知活性氧(reactive oxygen species,ROS)与糖尿病并发症息息相关,过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion,ONOO-)作为ROS家族的重要一员,其在糖尿病相关并发症中起重要作用。成骨细胞(osellecksteoblast,OB)作为骨形成和重建过程中的核心环节。但ONOO-是否参与高血糖引起的OB损伤尚不清楚。因此,了解ONOO-在高糖(high glucose,HG)诱导成骨细胞损伤的作用及其机制对于防治DOP具有重要的理论意义与临床应用价值。目的(1)探讨HG对小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1胞)的ONOO-水平的影响。(2)探讨ONOO-是否介导HG引起的MC3T3-E1细胞的损伤和铁死亡。方法1.应用高浓度(45mmol/L)葡萄糖(high glucose,HG)处理MC3T3-E1细胞构建HG损伤成骨细胞模型。2.应用细胞计数检测试剂盒-8(CCK-8)测定MC3T3-E1细胞存活率;3.应用 Dihydrorhodamine 123 检测 MC3T3-E1 细胞的 ONOO-水平;4.通过Western blot法检测3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT,ONOO-的标志物)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4,为反映能抑制铁死亡的蛋白分子)蛋白的表达水平;5.双氯荧光素(DCFH-DA)探针检测MC3T3-E1细胞内活性氧(ROS)水平;6.罗丹明123(Rh 123)染色法测定MC3T3-E1细胞的线粒体膜电位(MMP);7.碱性磷酸酶(ALP)检测盒测定MC3T3-E1细胞的ALP活性;8.茜素红染色法测定MC3T3-E1细胞内矿化结节;9.铁离子比色法测定铁离子Dorsomorphin说明书水平;10.丙二醛(MDA)试剂盒测定MDA水平;11.应用SPSS 22.0数据分析软件对实验数据进行统计分析,实验数据以均数±标准差(mean±SD)表述。单因素方差分析(one-way ANOVA)用于多样本均值之间的比较,运用最小显著差异法(LSD)检验进行多样本均数的两两比较,P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果一、HG诱导MC3T3-E1细胞ONOO-的生成增加HG(45mmol/L)能明显降低MC3T3-E1细胞存活率,并促进ONOO-水平及3-NT的表达增加。二、ONOO-介导HG诱导的MC3T3-E1胞损伤及铁死亡1.ONOO-解构剂(penortachlide,FeTMPyP)抑制 HG 引起的小鼠MC3T3-E1细胞存活率降低;2.ONOO-解构剂抑制HG对成骨细胞内ROS水平增加;3.ONOO-解构剂抑制HG对成骨细胞MDA生成增多;4.ONOO-解构剂抑制HG对成骨细胞线粒体膜电位(MMP)损伤;5.ONOO-解构剂对抗HG对成骨细胞ALP活性的抑制作用;6.ONOO-解构剂对抗HG对成骨细胞矿化结节生成的抑制作用;7.ONOO-解构剂对抗HG对成骨细胞铁离子分泌的促进作用;8.ONOO-解构剂对抗HG对成骨细胞GPX4蛋白表达的抑制作用。结论1.HG诱导MC3T3-E1细胞ONOO-的生成增加。2.ONOO-介导HG引起的小鼠MC3T3-E1细胞多种损伤和铁死亡