老黄酶(Old Yellow Enzyme,OYE)属于含有核黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶家族(EC 1.6.99.1),该酶天然反应涉及到Cr(VI)的还原,而谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)被证实能够有效修复污染土壤中的重金属,但该菌属的老黄酶从未被探索过,因此研究该菌属的老黄酶具有重要意义。此外,老黄酶具有不对称还原C=C键的烯烃还原酶活性,可以在水基介质和温和条件下生物催化柠檬醛生产香茅醛,但该类酶普遍存在催化活性低、稳定性较差等问题,其应用受到限制。本寻找更多研究在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中首次鉴定出一种具有六价铬还原酶活性以及烯烃还原酶活性的老黄酶(Cg OYE),通过半理性设计成功提高了该酶对底物Cr O_3的六价铬还原酶活性以及对底物柠檬醛的烯烃还原酶活性,进行了六价铬还原和不对称还原C=C键获得(R)-香茅醛或(S)-香茅醛的应用。具体研究内容如下:(1)将来源于C.glutamicum的老黄酶编码序列(Coding sequence,CDS)在E.coli BLPF-6463922采购21/p XMJ-19上克隆表达,以Cr O_3为底物进行酶学性质的检测,结果显示Cg OYE的比酶活为6.5 U·mg~(-1),最适温度为45℃、最适p H为7.5,温度在40-50℃和p H在7.0-7.5范围内具有较好的稳定性;(2)针对Cg OYE六价铬还原酶活性低、稳定性差等问题。以Cr O_3作为底物,通过分子动力学(MD)模拟,预测影响Cg OYE六价铬还原酶活性的相关位点。采用丙氨酸扫描突变以及饱和诱变方法,成功筛选出一株正向突变体I81G。该突变体比酶活为18.0 U·mg~(-1),相比于野生型比酶活提高了2.77倍,其热稳定性和p H耐受性得到改善。将该突变体在大肠杆菌中外源表达,并应用于六价铬的还原,反应48 h后E.coli BL21/p XMJ-19-Cg OYE(对照组)的Cr(VI)还原率为38.1%,而E.coli BL21/p XMJ-19_(I81G)将Cr(VI)全部还原成Cr(III),Cr(VI)还原率是对照组的2.62倍,菌体的OD_(600)是对照组的1.52倍;(3)Cg OYE具有烯烃还原酶活性,将其应用于生物催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-/(S)-香茅醛。由于底物(E/Z)-柠檬醛是混合异构体,将显著影响Cg OYE的催化活性以及立体选择性。针对Cg OYE催化(E/Z)-柠檬醛活性低下、稳定性差等问题,通过截短Cg OYE氮端区history of pathology域的肽链(Met1-Arg31),提高该酶的烯烃还原酶活性。在截短突变体N8、N20和N31中,N31的比酶活最高,为野生型的4.86倍,且该突变体的热稳定性和p H耐受性均得到显著提高;(4)针对N31-Cg OYE立体选择性较差问题,采用聚焦理化迭代位点特异性突变(Focused rational iterative site-specific mutagenesis,FRISM)作为Cg OYE突变的理论指导,对突变体N31进行半理性设计与改造。根据产物构型设计两条突变路线,最终获得两株优质突变体N31-Cg OYE_(I81L/W128A/H190A)和N31-Cg OYE_(H198A/H295L),其中突变数据表明Cg OYE保守位点H190和其它非保守组氨酸残基可作为“可调节门控”影响底物柠檬醛与酶活性口袋的结合,从而改变产物香茅醛的构象。最后,将Cg OYE突变体与枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶(Bs GDH)偶联,对反应体系进行优化。以220 m M(E/Z)-柠檬醛为底物,N31-Cg OYE_(I81L/W128A/H190A)提供(R)-香茅醛的绝对产量为2452.8 mg,转化率和ee值分别为99.4%和99.0%,另一个突变体N31-Cg OYE_(H198A/H295L)提供(S)-香茅醛的绝对产量为2781.2 mg,转化率和ee值分别为99.6%和98.7%。