Wilson病(Wilson’s disease,WD)是一种由ATP7B基因突变导致的常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病,是神经遗传病领域重点防治的疾病。课题组前期临床研究发现,脑型WD患者(尤其是出现严重运动障碍和病程较长的难治性脑型WD患者)常规驱铜治疗的疗效差,病情康复缓慢,生活质量和学习、工作能力明显下降,严重者甚至危及生命。因此,研究WD神经细胞的损伤机制及治疗策略对改善脑型WD患者的病情和预后有重要意义。基于WD诊疗的临床需求,课题组根据脑型WD患者的中医辨证研究结果,创用通腑养髓方治疗脑型WD患者获得显著疗效。基于相关基础和临床研究发现,WD除铜代谢障碍外还存在铁代谢障碍,这可能是其治疗效果不佳的原因之一。近期研究发现,一种铁依赖性非程序性细胞死亡方式(铁死亡)参与了多种神经遗传变性病的发生发展,与脑型WD的神经细胞损伤机制相契合,泛素结合蛋白(ubiquitin-binding protein,p62)-Kelch样ECH相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)-核因子E2-关联因子(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)信号通路是调控铁死亡的一个重要通路,是WD神经细胞损伤的潜在治疗靶点。课题组前期以WD模型TX乳鼠皮质神经元为研究对象的结果发现,WD神经元存在铁死亡损伤,p62-Keap1-Nrf2通路中Nrf2是调控TX小鼠神经元铁死亡的一个重要环节。有研究发现,p62是p62-Keap1-Nrf2通路的上游环节,可与Nrf2竞争结合Keap1,阻止Nrf2的降解,在通路调节中起关键作用。并有研究指出,发生铁死亡的神经细胞免疫荧光染色检测转铁蛋白受体(transferrin receptor,Tf R)表达水平增加、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平升高,并出现阳离子转运调控样蛋白1(cation transport regulator-like protein1,CHAC1)、过氧化物合酶2(peroxide synthase2,PTGS2)等铁死亡相关基因的表达异常,是铁死亡的特异性指标。基于此,本研究假设通腑养髓方通过激活p62抑制TX小鼠脑内铁死亡而具有对WD神经元损伤的保护作用,通过抑制p62的表达观察通腑养髓方治疗TX小鼠脑内Tf R表达水平、MDA水平,CHAC1、PTGS2等铁死亡相关基因的表达以及铁死亡相关蛋白的表达水平,并探讨其神经元损伤的保护机制。目的:调控p62观察通腑养髓方对WD神经元铁死亡的干预效应,并探讨通腑养髓方作用的具体环节与位点。方法:1.体外实验:制备通腑养髓方含药大鼠血清;Elisa法检测各组MDA水平;采用TUNEL染色法观察各组小鼠海马神经元损伤;荧光定量PCR的检测各组铁死亡相关基因表达;。2.体内实验:透射电镜观察线粒体超微结构;Fluoro-Jade B(FJB)染色观察小鼠神经细胞损伤程度;免疫荧光技术检测各组小鼠海马TStochastic epigenetic mutationsf R的表达量;Elisa法检测各组MDA水平;荧光定量PCR的检测各组铁死亡相关基因表达;Western Blotting法分析各组铁死亡相关蛋白及通路相关蛋白的表达。结果:1.小鼠丙二醛MDA水平的表达:与DL组比较,TX组脑内MDA水平显著上升(P<0.01);与TX组比较,TX+DFO组和模型+Fer-1组脑内,MDA水平显著下ICI 46474采购降(P<0.01)。与NC组相比,MOD组、NC+Fer-1组MDA水平显著升高(P<0.01);与MOD组相比,MOD+DFO组、MOD+Fer-1组MDA水平显著降低(P<0.01)。与TX组比较,TX+TFYS组MDA水平显著下降(P<0.01);治疗后TX+sip62;与MOD组相比,MOD+TFYS组MDA水平显著降低(P<0.01)。2.各组小鼠线粒体结构的观察:DL组、DL+DFO组、DL+Fer-1组小鼠脑组织细胞线粒体结构正常;TX组小鼠脑组织细胞线粒体膜皱缩,嵴数量减少或消失,出现空泡;TX+DFO组、TX+Fer-1组与TX组比较,线粒体膜平滑,嵴数量增加,损伤程度减轻。TX+sip62组小鼠脑组织细胞线粒体膜皱缩,嵴数量减少或消失,出现空泡;TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组与TX组比较,线粒体膜平滑,嵴数量增加,损伤程度减轻。3.各组小鼠CHAC1、PTGS2m RNA的表达:与DL组比较,TX组CHAC1、PTGS2m RNA均显著升高(MRTX849分子量P<0.01);与TX组比较,TX+DFO组、TX+Fer-1组CHAC1、PTGS2m RNA均显著降低(P<0.01);与DL组比较,DL+DFO组、DL+Fer-1组CHAC1、PTGS2m RNA无显著差异。与DL组比较,TX组、TX+sip62组CHAC1、PTGS2m RNA均显著升高(P<0.01);与TX组比较,TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组CHAC1、PTGS2m RNA均显著降低(P<0.01)。4.通腑养髓方对Tf R表达水平的影响:与DL组比较,TX组Tf R表达水平显著增加(P<0.01);与TX组比较,TX+DFO组Tf R表达水平显著减少(P<0.01)。5.通腑养髓方减轻小鼠皮质神经细胞的损伤:与DL组比较,TX组、TX+sip62组小鼠皮质神经细胞损伤程度显著增加(P<0.01);与TX组比较,TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组皮质神经细胞损伤程度显著减少(P<0.01)。6.通腑养髓方减轻海马神经元的凋亡:与MOD组比较,MOD+TFYS组海马神经元凋亡数目显著减少。7.通腑养髓方对铁死亡通路相关蛋白表达的影响:与DL组相比,TX组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著下降(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著上升(P<0.01)。与TX组相比,TX+DFO组、TX+Fer-1组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著上升(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著下降(P<0.01)。与DL组相比,TX组、TX+sip62组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著下降(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著上升(P<0.01),p62磷酸化显著降低(P<0.01)。与TX组相比,TX+TFYS组、TX+sip62+TFYS组小鼠脑内GPX4蛋白表达水平显著上升(P<0.01),Tf R、ACSL4蛋白水平显著下降(P<0.01),p62磷酸化显著升高(P<0.01)。结论:p62-Keap1-Nrf2通路在TX小鼠神经元铁死亡的发生中发挥重要作用;通腑养髓方通过促进p62的磷酸化,显著减少铁死亡导致的神经元损伤,降低TX小鼠神经元氧化应激水平,起到WD神经保护的作用。