血管紧张素受体与补体C3a和C5a受体在CKD 4期IgA肾病快速进展中的作用及其相关性研究

背景IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)目前仍是世界范围内最常见的原发性肾小球肾炎,是导致终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因,但具体发病机制尚不完全清楚。个人疾病表现的异质性使得部分患者在就诊时已处于肾功能严重受损的状态,由于此时肾活检发生出血等各种并发症的风险较高,因此这部分患者临床上很少再进行肾穿刺活检明确诊断,针对这些患者的研究也比较有限。肾脏局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)和补体系统的过度激活在IgAN的发生和疾病进展中起到了重要作用。目前RAS抑制剂仍是治疗IgAN的主要药物,但对肾功能处于慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)4期的患者能否继续从中获益还存在诸多争议;补体C3a和C5a是终末途径C3和C5活化产生的小分子片段,具有“致敏毒素”作用,有关C3a和C5a及其受体在IgAN中的作用还不完全清楚,有研究发现补体C3a和C5a及其受体在IgAN中表达增加,但在CKD 4期的患者肾小球中的表达水平及其与肾功能进展和预后的关系目前鲜有报道。IgAN的主要病理表现之一是系膜细胞增生和细胞外基质合成增加,系膜细胞可以同时表达血管紧张素受体及补体C3a和C5a受体。在某些病理状态下,RAS与C3a和C5a及其受体之间存在相互关联,但在肾脏系膜细胞中上述二者间的相关关系还有待于进一步探究。目的1.探讨CKD 4期的IgAN肾组织局部RAS受体表达情况和应用RAS抑制剂与预后的关系;2.探讨CKD 4期的IgAN肾组织局部补体C3a和C5a及其受体的表达情况及与肾功能进展的关系;3.探讨体外培养的人肾小球系膜细胞中Ang Ⅱ刺激对补体C3a和C5a受体表达及纤维化相关基质合成的影响,初步探索RAS与补体C3a和C5a受体在肾脏系膜细胞中的相互关系。方法1.研究对象为2010年1月1日至2020年12月31日于中日友好医院经肾活检确诊为IgAN、且肾穿时肾功能处于CKD 4期的患者,收集临床及病理diABZI STING agonist作用资料、治疗用药情况等,同时通过免疫组化染色方法检测患者肾活检组织中血管紧张素受体AT1R、AT2R、MasR和MrgD的表达情况,比较其在肾功能进展组和稳定组中的表达差异,并分析使用RAS抑制剂对该部分患者预后的影响。2.研究对象为2010年1月1日至2021年12月31日于中日友好医院经肾活检确诊为IgAN、且肾穿时肾功能处于CKD 4期的患者,收集临床及病理资料,同时通过免疫组化染色方法检测患者肾活检组织中补体C3、C3a和C5a及其受体C3aR、C5aR及C5b-9的表达情况,比较各成分在肾功能进展组和稳定组中的表达差异,并重点关注C3a和C5a及其受体与基线肾功能、肾功能衰退速度和IgAN病理分型评分间的关系。3.体外培养人肾小球系膜细胞系,分为对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ+缬沙坦干预组和单纯缬沙坦干预组,给予适宜浓度和时间的上述药物刺激,进行细胞荧光染色、流式细胞分析、WB检测系膜细胞AT1R、C3aR和C5aR的表达变化,收集细胞上清采用 ELISA 法检测 Fibronectin(FN)、Laminin(LN)和 CollagenⅣ(Col Ⅳ)表达,初步探讨系膜细胞中RAS和补体之间的关系。结果1.该部分研究共纳入50例患者,3年随访期满进入ESRD者(进展组)21例,肾功能仍稳定在CKD 4期者(稳定组)29例,两组患者在基线时肾功能、24小时尿蛋白定量等重要指标无明显差异。6例患者基线eGFR位于15-20 ml/min/1.73m2,未使用RAS抑制剂,均快速进展至ESRD。进展组有1/3的患者肾活检后使用了 RAS抑制剂,比例远低于稳定组(33.3%v.s.62.1%,P=0.045);对所有基线eGFR为20-30 ml/min/1.73m2的患者,未进行RAS抑制治疗的患者肾脏中位生存时间为30.5个月,明显短于进行RAS抑制治疗组(P=0.006)。免疫组化染色结果显示CKD 4期IgAN患者肾小immunoglobulin A球、肾小管间质及肾血管中AT1R、AT2R、MasR和MrgD四种受体的表达水平较对照组(CKD1期)患者显著增加,但在CKD 4期IgAN的进展组和稳定组之间表达水平无明显统计学差异。2.该部分研究共纳入69例患者,3年随访期满进入ESRD组26例,非ESRD组43例,两组在基线时肾功能、24小时尿蛋白定量等重要指标无明显差异。直接免疫荧光结果显示ESRD组C3沉积强阳性(≥ 3+)比例较非ESRD组明显增高(84.6%v.s.46.5%,P=0.004);C3荧光强度≥3+患者的肾脏中位生存时间为33.0个月,明显短于C3荧光强度≤ 2+者(P=0.031)。免疫组化染色显示CKD 4期IgAN患者肾小球中C3、C3a和C5a及其受体C3aR、C5aR及C5b-9的表达较CKD 1期患者明显增加,且ESRD组的表达水平明显高于非ESRD组;C3a和C3aR、C5a和C5aR的表达强度与CKD 4期IgAN患者基线eGFR水平和肾功能下降的平均速度呈显著负相关,与基线24小时尿蛋白定量水平呈正相关;C3a和C5a的沉积可能分别与牛津分型中的S和T的高评分有关。3.在体外培养人肾小球系膜细胞中,CCK-8增殖检测确定AngⅡ最佳刺激浓度和时间为10-5 mol/L刺激24h,缬沙坦的干预浓度为10-6mol/L。各组细胞经各自处理后,细胞免疫荧光染色、WB结果显示AngⅡ刺激后,系膜细胞AT1R、C3aR和C5aR表达均明显增加,加入缬沙坦干预后上述受体Entinostat采购的表达较刺激组明显下降,但仍高于空白对照,单纯缬沙坦干预组较对照组无明显差别;流式细胞分析可见AngⅡ刺激后C3aR-APC(+)/C5aR-PE(+)双阳性细胞的比例明显增高,每个单荧光强度的峰值也明显增加,缬沙坦阻断AT1R后可使上述比例和峰值明显下降;AngⅡ刺激后细胞上清中分泌的FN、LN和Col Ⅳ明显增加,缬沙坦可以缓解上述细胞外基质的过度合成。结论1.CKD 4期IgAN患者肾脏局部RAS受体表达明显增加,基线eGFR和是否使用RAS抑制剂是影响患者肾脏预后的重要因素;对肾小球滤过率处于20-30 ml/min/1.73m2水平、且伴大量蛋白尿的IgAN患者,在临床严密监测肾功能及血钾水平的情况下,仍可以考虑使用RAS抑制剂治疗。2.CKD 4期IgAN肾小球C3a和C5a的沉积及C3aR和C5aR的表达与基线eGFR和eGFR的平均下降速度呈显著负相关,与基线24小时尿蛋白水平呈正相关,上述因子的高表达可能加快CKD 4期IgAN患者肾功能进展至终末期肾病。3.在体外培养的人肾小球系膜细胞中,AngⅡ刺激通过作用于AT1R,可以促进系膜细胞补体受体C3aR和C5aR的表达,促进系膜细胞增殖及分泌Ⅳ型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白等纤维化相关的细胞外基质,阻断AT1R可以明显改善上述变化。