研究目的突发性聋(sudden sensorineural hearing loss,SSNHL)是耳鼻咽喉科常见急症之一,表现为不明原因的、突然发生的听力下降,预后往往不佳。SSNHL的病因及发病机制尚不明确,血管性疾病、传染性疾病、肿瘤等均可引起SSNHL。因内耳血管多为终末支,且无侧支循环,因此血管血栓或出血都会导致耳蜗血流量减少,从而给耳蜗带来严重的损伤,故内耳微循环障碍与SSNHL的发生发展密切相关。研究表明血液学指标可反映SSNHL患者预后。血栓弹力图(thromboelastography,TEG)是反映血液凝固动态变化的指标,可以更敏感地反映机体的凝血状态,可能在预测SSNHL预后方面具有指导意义,但目前鲜有研究明确TEG与SSNHL预后的关系。为了更好地评估SSNHL,本研究旨在探究TEG与SSNHL的临床特征及预后的关系。研究方法回顾性分析了 2020年3月至2020年9月期间在山东省耳鼻喉医院住院治疗的SSNHL患者,纳入及排除标准为:首次发病且病程≤2周;年龄18-70岁,无血液或免疫系统相关疾病;排除蜗后病变、中耳病变、听神经瘤、遗传因素及其他致病因素;无糖皮质激素使用禁忌,非妊娠期妇女;入院前未接受治疗。收集患者的病史、听力学检查、前庭功能检查、辅助检查结果和疗效。听力学检查包括纯音听阈测试、声导抗、畸变产物耳声发射和听性脑干反应。前庭功能检查包括双温试验、肌源性前庭诱发电位、头脉冲试验、前庭自旋转试验。辅助检查包括常规血液检查、TEG和内耳核磁共振检查。TEG有正常、高凝和低凝三种结果。高凝表现为反应时间(reactiontime,R)减少、凝固时间(kinetic time,K)减少、α角(α-angle)增大、G值和最大幅值(maximumamplitude,MA)增大。低凝表现为R值增大、K值增大、α角减小、G值和MA值减小。对于TEG为高凝或低凝的患者,需要额外收集一周后复查的TEG结果,两次结果的差异用ΔTEG表示。应用SPSS20.0软件分析TEG、TEG中各参数(R值、K值、α角、G值和MA值)、ΔTEG、ΔTEG中各参数(ΔR、ΔK、Δα、ΔG和ΔMA)与各临床特征和预后的关系,P<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果133名患者被纳入研究。TEG与SSNHL患者预后(P=0.049)、听力下降程度(P=0.030)和听力下降类型(P=0.013)均存在相关性。R(P=0.002)与α角(P=0.010)和预后存在相关性,MA(P=0.022)和G(P=0.020)与听力下降程度存在相关性。R(P=0.033)与内耳磁共振存在相关性。ΔG(P=0.010)与纤维蛋白原存在相关性。ΔTEG(P=0.032)与异常TEG患者的疗效存在相关性。Logistic回归分析显示,TEG与疗效(P=0.013)存在相关性,ΔTEG与疗效(P=0.013)和眩晕(P=0.016)存在相关性。研究结论总的来说,TEG是影响SSNHL预后的独立危险因素,R值和α角的异常提示预后较差,而MA值和G值的异常则预示着更严重的听力损失。SSNHL患者预后同时与TEG变化情况存在相关性。因此,TEG可作为SSNHL的预后评估指标。研究目的GSDME(DFNA5)基因是已知的非综合征型感音神经性耳聋相关基因,呈常染色体显性遗传。GSDME是语后聋相关基因,携带该基因致聋突变的患者在10岁左右出现高频听力下降,而后逐渐累及全频。前期我们对收集的45个语后聋家系利用全外显子组测序进行基因诊断,发现4个家系可以明确为GSDME基因突变致聋。目前已报道的14个GSDME基因致聋突变,均位于8号外显子附近,其致聋机制还不清楚。GSDME是gasdermin家族(GSDMA,GSDMB,GSDMC,GSDMD,GSDME,PJVK)成员之一,除PJVK含有一个截短C末端结构域,其他蛋白都含有一个N末端细胞毒性结构域(成孔/诱导焦亡活性)和一个C末端抑制结构域(抑制N末端活性)。活化的caspase,颗粒酶B等蛋白酶切割Gasdermin蛋白释放具有穿孔活性的N端结构域,触发细胞焦亡。GSDME致聋突变位点会导致mRNA在8号外显子处跳跃性剪接,翻译产生截短蛋白,导致GSDME-C端结构域变短,对N端活性的抑制作用变弱。因此我们推测GSDME基因突变致聋机制可能与细胞焦亡相关。本研究在动物和细胞水平深入探究GSDME基因突变致聋的分子机制。研究方法1.收集GSDME基因突变致聋家系的基本信息,并探究Gwww.selleck.cn/products/StaurosporineSDME基因突导致mRNA水平的变化。2.构建GSDME基因野生型(GSDME-WT)和缺失8号外显子的突变体(GSDME-Mut)pcDNA3.1 表达质粒。3.动物实验:(1)通过圆窗注射分别将in vivo-jetPEI包裹的GSDME-WT、GSDME-Mut、pcDNA3.1空载体递送至出生10天的C57BL/6小鼠耳蜗;(2)圆窗注射4周后通过听性脑干反应(Auditory brainstem responses,ABR)和畸变产物耳声发射(Distortion product optoacoustic emission,DPOAE)检测小鼠的听力水平;(3)解剖检测完ABR和DPOAE小鼠的耳蜗基底膜,观察毛细胞数量。4.细胞实验:(1)利用 Lipo-3000 将 GSDME-WT、GSDME-Mut、pcDNA3.1空载体分别转染至293T细胞;(2)显微镜下观察细胞形态,并检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenoccult HCV infectionase,LDH)水平;(3)通过免疫印迹实验(western blot,WB)检测GSDME蛋白及炎症因子IL-1β的表达水平;(4)利用免疫荧光、WB检测细胞凋亡水平(5)使用不同浓度的双硫仑(disulfiram,DIS)和富马酸二甲酯(dimethylfumarate,DMF)处理 293T 细胞,2h 后转染 GSDME-Mut,转染后 48 h通过细胞形态和WB实验分析药物对GSDME-Mut细胞毒性的缓解作用。研究结果1.45个语后聋家系中有4个家系是由GSDME基因突变导致的耳聋,其中3个家系均是GSDME基因c.991-15_991-13del突变致聋,另一个家系是由c.1183+4 CeralasertibA>G突变致聋。2.通过动物实验发现,圆窗注射GSDME-Mut后小鼠ABR阈值和DPOAE阈值明显升高,耳蜗基底膜底转和中转的毛细胞(内毛细胞和外毛细胞)几乎全部丢失,顶转仅有少量内毛细胞存活。3.通过细胞实验发现,GSDME-Mut会引发细胞焦亡,主要伴随GSDME-N端蛋白水平升高,LDH水平升高及炎症因子IL-1β水平的升高等。4、通过免疫荧光发现GSDME突变体不仅定位到细胞膜,同时也分布于线粒体,而且GSDME-Mut组TUNEL染色阳性,通过WB进一步分析发现GSDME-Mut 组的细胞色素 C 和活化的 caspase3 表达上调,这些结果表明 GSDME-Mut 会导致细胞凋亡的发生。5、DIS和DMF能有效减轻细胞焦亡,缓解GSDME-Mut的细胞毒性。研究结论GSDME基因的致聋突变导致mRNA发生跳跃性剪接,产生的截短蛋白失去了C端对具有成孔效应N端的抑制作用,同时引发了细胞焦亡和细胞凋亡;使用DIS或DMF可以有效缓解GSDME基因突变体的细胞毒性。本研究初步揭示了 GSDME基因突变导致耳聋发生的分子机制,并对该基因导致的耳聋的治疗提供了新的视角。