研究背景口腔软组织是口腔内部的屏障,但由于疾病、手术、炎症、机械创伤等因素往往会引起口腔内软组织的创伤和缺损。口腔环境中存在着大量定植的菌群,当发生损伤后,容易诱发感染。由于咀嚼的原因,口腔黏膜或牙龈损伤后在愈合的过程中更容易出现二次创伤。口腔软组织的愈合还受到其他一些全身性因素的影响,全身系统性疾病如糖尿病、肿瘤放疗治疗等,这些原因使口腔内的软组织创伤或缺损的修复面临着较大的挑战。伤口长期不愈合,可能会继发局部感染甚至菌血症等全身症状。一些手术后如转瓣手术、植骨手术等创口的延迟愈合,会影响术后效果,如果严重将会导致手术失败。目前促进口腔内软组织创伤修复的方式主要包括药物如生长因子、物理治疗以及使用软组织移植物,这些方法虽然能取得较好的疗效,但还有一些局限性。例如持续使用生长因子可能诱发恶性增殖,在口腔内高频率和长时间的用药可能会引起误服而导致副作用;自体黏膜移植需要供体术区,创伤大,更痛苦;同种异体组织移植可能会BMS-907351供应商引起机体免疫排斥反应;人工合成的移植材料在愈合的过程中容易发生血管化不良,影响其正常愈合。前期研究发现,多肽KPHAEVVLR(KR-9)是一种经蛋清水解纯化及鉴定后得到的活性肽,具有促进小鼠皮肤愈合的功能,其主要作用是能够促进人皮肤成纤维细胞胞膜热休克蛋白90α的分泌、细胞的迁移和轻度的增殖。KR-9作为一种能够促进软组织修复的活性肽,具有制备方便,成本低,生物安全性高等优点。其主要作用为促进细胞的迁移,这使其在促进软组织修复方面更具优势,可以避免过度增生;KR-9来源于食物蛋白的水解,作为口腔内用药更具有应用潜力,长期使用不会产生副作用。因此我们将对KR-9是否能促进口腔软组织的创伤修复及其产生作用的机制进行探讨,KR-9的应用将为加速口腔软组织缺损的愈合及软组织修复材料的制备提供新的治疗策略和方法。研究方法(1)提取人牙龈成纤维细胞(Human Gingival fibroblast,HGF),将梯度浓度的KR-9作用于HGF,使用CCK-8法检测KR-9对细胞活力的影响,并根据结果筛选多肽后续的实验浓度。使用经筛选后合适浓度的KR-9与牙龈成纤维细胞相互作用,采用划痕实验及Transwell实验检测KR-9对细胞迁移的影响。(2)使用激光共聚焦显微镜检测KR-9在细胞的定位情况。采用转录组测序检测KR-9处理的实验组及未处理的对Captisol使用方法照组人牙龈成纤维细胞内基因的表达差异。根据测序结果分析KR-9可能的作用机制与激活PI3K/AKT/mTOR信号通路相关。采用免疫印迹法(Westernblot)检测多肽对人牙龈成纤维细胞PI3K/AKT/mTOR通路标志蛋白表达的影响。对细胞使用PI3K抑制剂后,检测对照组、抑制剂组、抑制剂+KR-9组AKT/mTOR蛋白磷酸化水平,HGF迁移及增殖的情况。(3)通过CCK-8法检测KR-9对人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)细胞活力的影响,筛选合适浓度。采用Westernblot实验检测KR-9对HUVEC细胞PI3K/AKT/mTOR通路标志蛋白磷酸化的影响。划痕实验及Transwell实验检测KR-9对HUVEC迁移的影响。基质胶管腔结构形成实验检测KR-9对HUVEC细胞成管的影响。使用PI3Genomic and biochemical potentialK抑制剂后,检测对照组、抑制剂组、抑制剂+KR-9组HUVEC增殖、迁移以及成管情况。(4)检测KR-9清除ABTS~+及DPPH自由基能力,测定其体外抗氧化能力。CCK-8法检测KR-9对H_2O_2诱导损伤的HUVEC细胞活力改变情况。采用DCFH-DA荧光探针检测KR-9对HUVEC氧化损伤后细胞内ROS含量的影响。(5)构建大鼠上颌硬腭黏膜缺损模型,实验组创口处使用200μM KR-9处理,对照组使用同体积生理盐水,术后3,5,7,11天分别处死大鼠,使用相同标准对创口拍照,对比各组未愈面积;H&E染色检测创伤之间的距离,免疫组化检测CD31,观察新生修复组织内血管形成情况。研究结果(1)成功提取人牙龈成纤维细胞,浓度为50～200μM的KR-9能够促进HGF的增殖,浓度为300μM、400μM的KR-9抑制细胞的活力,后续实验使用KR-9浓度上限为200μM。浓度为50～200μM的KR-9能促进人牙龈成纤维细胞的迁移,促进作用具有剂量依赖性。(2)经检测KR-9能进入到HGF细胞内,转录组测序结果显示PI3K/AKT通路检测到的差异基因最多。KR-9提高HGF细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平,激活HGF细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路。PI3K抑制剂LY294002使AKT、mTOR的磷酸化水平降低,KR-9能使降低的磷酸化水平部分升高。KR-9促进细胞增殖及迁移的作用被LY294002抑制。(3)50～200μM的KR-9能促进HUVEC增殖,浓度为300μM的KR-9抑制HUVEC的活性。50～200μM的KR-9能促进HUVEC迁移和体外管腔结构形成,随着浓度的增加作用逐渐增强。KR-9提高HUVEC细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平,激活HUVEC细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路。KR-9促进细胞增殖、迁移及成管的作用被LY294002抑制。(4)25～200μM的KR-9具有抗氧化活性,能在体外促进ABTS~+以及DPPH自由基的清除。25～200μM的KR-9提高H_2O_2诱导损伤的HUVEC的细胞存活率,随着多肽浓度的提高,作用逐渐增强。KR-9能减少H_2O_2诱导的氧化损伤的HUVEC内的ROS含量,随着多肽浓度增加,作用逐渐增强。(5)KR-9促进大鼠上颌硬腭黏膜创伤修复,加速创口愈合,在口腔软组织缺损愈合期促进新生组织内血管生成。结论(1)KR-9通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进HGF迁移、增殖。(2)KR-9通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进HUVEC增殖、迁移及成管作用。(3)KR-9具有抗氧化作用,能提高H_2O_2损伤的HUVEC的存活率,降低损伤的HUVEC中ROS的含量。(4)KR-9促进大鼠上颌硬腭黏膜缺损愈合及修复过程中血管的形成。