近年来研究显示,树突状细胞肿瘤疫苗(Dendritic cell tumor vaccine,DC-vac)在非小细胞肺癌(non-small cell lungs cancer,NSCLC)等恶性肿瘤临床干预中取得积极进展。然而,其干预效应有待提高,副作用仍待改善。蒲公英甾醇(taraxasterol,Tara)是从蒲公英植株中提取的一种五环三萜类天然植物甾醇,具有抗炎、抗癌和抗氧化等多种药理活性。然而Tara是否能提高DC-vac治疗NSCLC疗效及改善其副作用尚未有研究探讨。本研究主要内容简述如下:目的:观察Tara联合DCs-vac治疗鼠源Lewis肺腺癌(Lewis lungs carcinoma,LLC)移植瘤的效果;整合网络药理学、RNA-seq及流式细胞术等技术,探讨联合治疗的分子机制,以期为后续开发DCs-vac联合中药天然成分干预NSCLC的临床新策略提供前期研究基础。方法:1.常规制备DCs-vac:提取6-10周龄的CD45.1~(+/+)C57BL/6小鼠骨髓原代细胞(Bone marrow-derived cells,BMCs),加入GM-CSF(40ng/ml)和IL-4(20ng/ml)诱导成骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs);同时镜下观察细胞生长形态并拍照;通过流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)检测DC细胞诱导纯度,及DCs成熟情况;利用冻融法提取鼠源NSCLC细胞株LLC细胞(Lewis lungs carcinoma cells,LLCs)全抗原,荷载给DCs制备成抗LLCs的DCs-vac。2.观察Tara联合DCs-vac体内治疗小鼠NSCLC疗效:将LLCs(8×10~5/只)皮下注射C57BL/6野生型(wild type,WT)小鼠,建立小鼠NSCLC移植瘤模型;成瘤小鼠随机分为4组(n=5):PBS对照组,taraxasterol(Tara)组,DC瘤苗(DCs)组,Tara联合DC瘤苗(DT)组,分别以如下方法进行干预:PBS对照组:腹腔注射PBS(0.2ml/只),每3天一次,共注射6次;Tara组:腹腔注射Tara(10mg/kg),每3天注射一次,共干预6次;DCs组:尾静脉注射DCs-vac(1×10~6个/只),每7天注射1次,共干预3次;DT组:首次腹腔注射Tara(10mg/kg)12 h后尾静脉注射DCs-vac(1×10~6个/只),然后Tara每3天注射一次,共计干预6次,DCs-vac每7天注射1次,共计干预3次;监测并记录各组模型小鼠肿瘤生长情况,绘制生长曲线;在PBS组,Tara组,DT组小鼠末次干预后第3天,DCs组小鼠末次干预后第4天,麻醉处死各组小鼠,收集血清、肿瘤和主要脏器;H&E染色观察各组小鼠肿瘤与肺脏组织病理学变化。3.观察模型小鼠外周免疫器官CD4、CD8 T细胞的比例和功能变化:FCM法检测脾脏中CD4~+T、CD8~+T细胞比例及活化分子(CD62L、CD69)和细胞因子(IL-4、IFN-γ)的表达变化;并利用FCM检测模型小鼠肿瘤同侧的引流淋巴结(draining lymph nodes,DLN)中CD4~+T、CD8~+T细胞增殖抗原Ki-67和活化分子CD69的表达变化。4.观察模型小鼠肿瘤局部CD4、CD8 T细胞浸润和功能变化:利用免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)观察各组小鼠肿瘤局部免疫细胞CD4~+T,CD8~+T细胞的浸润情况,及CD8~+T细胞表达IFN-γ情况。5.观察Tara对DCs-vac成熟及肿瘤局部浸润的影响:在体外通过CCK-8实验检测Tara对DCs-vac细胞活性影响;利用FCM检测Tara对DCs-vac细胞膜分子MHCII,CD80,CD86表达的影响;IF观察各组小鼠肿瘤局部DCs浸润的情况。6.观察Tara对肿瘤细胞凋亡的影响:TUNEL法检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况;AV-PI双染法分析LLCs体外凋亡情况。7.观察细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)对肿瘤细胞的杀伤作用:将瘤细胞全抗原(200μg/只)皮下注射6周龄C57BL/6 WT小鼠,每7天免疫1次,共3次;末次免疫后第7天麻醉处死小鼠,解剖脾脏并制成单细胞悬液,利用免疫磁珠分选技术(Magnet-Activated Cell Sorting,MACS)分选脾CD8~+T淋巴细胞;按不同效应细胞:靶细胞比例共培养CD8~+T细胞和LLCs,然后利用FCM检测LLCs凋亡率;并利用IF观察各模型肿瘤组织中CD8~+T细胞和凋亡细胞的共定位情况。选取各组小鼠肿瘤组织,进行转录组测序(RNA Sequencing,RNA-seq),分析各组肿瘤组织RNA-seq结果中各凋亡途径相关分子的表达情况。8.分析Tara联合DCs-vac体内治疗小鼠NSCLC的相关信号通路:对各组模型RNA-seq结果进行整体分析,鉴定并筛选出差异表达基因(differentially expressed gene,DEG),通过KEGG富集分析和Venn分析,SBE-β-CD细胞培养初步筛选出变化最为明显的通路后,进一步分析该通路相关基因在各组间差异表达情况;再利用Real-time RT-PCR,Western Blot,IF等技术,在体内、外验证候选生物学途径靶基因及其产物表达水平。9.观察Tara对鼠源NSCLC细胞生长和转移的影响:通过CCK-8实验、划痕实验、克隆形成实验等和鬼笔环肽染色检测Tara在体外对LLCs的增殖生长、迁移、克隆形成能力及细胞骨架变化的影响;FCM分析细胞周期变化;IF检测体外LLCs中和肿瘤组织局部增殖核抗原Ki67的表达;Real-time RT-PCR检测LLCs中细胞生长周期相关蛋白依赖性激酶CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6,以及上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程与转移相关基因MMP2、MMP3、MMP9的表达变化;Western Blot检测与生长相关的分子CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin B1、Cyclin D1、p21和p53,以及EMT与肿瘤细胞转移相关分子MMP2、MMP3、N-Cadherin、Vimentin的蛋白水平变化。10.结合网络药理学和分子对接技术筛选Tara的潜在作用靶点:利用Pub Chem化合物数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索Tara的结构式;通过STITCH(http://stitch.embl.de/),Pharm Mapper(http:/www.lilab-ecust.cn/pharm),Swiss Target Prediction(http:/www.swisstargetprediction.ch/)等数据库来预测Tara潜在结合的靶点;通过Mouse Genome Informatics(http://www.informatics.jax.org/)数据库筛选小鼠肺腺癌(lungs adenocarcinoma,LUAD)的相关基因;Venn分析确定Tara预测靶点和小鼠LUAD相关基因的交集;利用String和David数据库分析各交集靶点之间的蛋白质互作网络关系(Protein-Protein Interaction Networks,PPI),并分析它们协同干预的细胞功能(GO分析)和代谢通路(KEGG分析)等;利用Cytoscape软件中CBiomaterials based scaffoldsyto NCA插件对交集靶点进行中心度值(degree)分析,取degree排名前30个Tara干预鼠源LUAD的核心靶点,进行(Autodocktools、vina等软件)Tara-核心靶蛋白对接模拟验证,分析各潜在结合靶蛋白与Tara的结合能及结合状态(根据形成的相互作用力,以及复合物的结合能判断)。接着利用Pymol软件,将构建的与Tara成功对接的靶分子,配-受复合物的3D结构结合示意图可视化。最后,根据RNA-seq结果KEGG富集分析出的通路及关键基因,结合现有文献报道,筛选出对接的30个Tara干预鼠源LUAD的核心靶点中影响该KEGG通路基因表达的潜在靶点;通过Western Blot、FCM检测Tara体外对LLCs中靶蛋白及其磷酸化形式的表达水平影响;IF检测体内各模型组肿瘤组织中磷酸化靶蛋白表达情况。11.观察各模型组脏器病理学及血清炎性因子变化:H&E染色观察各组小鼠心,肝,脑,肾脏等重要脏器组织病理学变化;酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清中细胞因子IFN-γ,IL-10和TNF-α水平。结果:1.FCM结果显示:经IL-4和GM-CSF诱导刺激的BMDCs其CD11c阳性率达到95%以上(P<0.01);显微镜下观察可见:BMCs体积小,呈圆形,漂浮生长;而BMDCs细胞呈不规则形,体积逐渐增大,贴壁分裂成团生长,随着枝状突起伸出增加渐成半贴壁生长;DCs-vac表面毛刺状伪足明显增加,粗而密,细胞多呈悬浮生长,提示培养诱导BMDCs成功。FCM检测各组DCs的成熟情况,结果显示:培养5天未成熟的DCs(immature dendritic cells,i DCs)低表达MHCII,CD80和CD86分别为40%,36%及21%左右,而DCs-vac大量表达MHCII,CD80和CD86,分别约90%,75%和70%。2.观察肿瘤生长情况:与PBS组相比,Tara和DCs单一治疗组均能一定程度抑制肿瘤生长(P<0.01)。但与其他三组相比,DT组小鼠的肿瘤生长最为缓慢(P<0.01),治疗效果最优。H&E染色结果显示:与PBS组相比,各治疗组肿瘤细胞核质较为疏松,可见碎裂,肿瘤局部有不同程度的出血坏死和纤维化;但DT组瘤细胞核碎裂最为明显,坏死区域面积最大;且DT组肿瘤肺转移灶最少(P<0.01)。3.各模型组小鼠脾脏分析结果显示:相较于PBS组,Tara组小鼠脾脏减小(P<0.05),脾细胞数减少(P<0.01);DCs组小鼠脾脏增大(P<0.01),脾细胞数最多(P<0.01);DT组小鼠脾脏增大(P<0.01),脾细胞数升高(P<0.01),但DT组相较DCs组小鼠脾脏体积、重量及细胞数有所减小。脾细胞FCM检测结果显示:与PBS组相比,DCs组CD8~+T细胞比例显著上调(P<0.01),Tara组CD4~+T细胞比例显著上调(P<0.01),DT组CD4~+T、CD8~+T细胞比例皆上调(P<0.05);DCs组活化的CD69~+CD4~+T细胞、CD69~+CD8~+T细胞比例以及CD8~+T细胞中IFN-γ表达水平上调最显著(P<0.01),DT组次之(P<0.01),Tara组相对较少(P<0.05);Tara组CD62L~+CD4~+T细胞比例及CD4~+T细胞的IL-4表达水平上调最显著(P<0.01),DT组次之(P<0.05),DCs组CD4~+T细胞表达IL-4变化不明显(P>0.05)。这些结果提示:Tara显著诱导NSCLC模型小鼠体内Th 2型免疫应答,联合治疗时削弱了DT组中DCs-vac诱发的Th 1型免疫应答。进一步检测DLN中CD4~+T、CD8~+T细胞增殖活化情况,结果显示:各组模型DLN中的CD4~+、CD8~+T细胞与脾脏中的变化相似。与PBS组相比,DCs组DLN中CD8~+T细胞、活化的CD69~+CD8~+T细胞比例以及CD8~+T细胞增殖抗原Ki-67的表达上调最显著(P<0.01),DT组次之(P<0.05),Tara组CD8~+T细胞增殖活化不明显(P>0.05);而Tara组CD4~+T细胞比例及CD4~+T细胞Ki-67表达水平上调最显著(P<0.01),而活化的CD69~+CD4~+T细胞比例减少(P<0.01)。以上数据再次提示:在DC瘤苗干预的情况下,Tara会一定程度的下调NSCLC小鼠CD8~+T细胞的增殖活化。4.肿瘤局部T淋巴细胞检测结果显示:各治疗组肿瘤中CD4~+T细胞浸润显著上调(P<0.01),其中Tara组CD4~+T细胞浸润数最多(P<0.01),DT组次之(P<0.01),DCs组最少(P<0.01);DCs及DT组肿瘤局部均明显增加了CD8~+T细胞的浸润(P<0.01),且CD8~+T细胞显著表达IFN-γ(P<0.01);但相较于DCs组时,DT组肿瘤局部CD8~+T细胞浸润数及IFN-γ的表达被削弱(P<0.05)。综上外周免疫器官FCM和肿瘤组织IF结果提示:DT组联合治疗诱发的免疫应答反应,可能并不是抑制肿瘤生长的关键因素。5.CCK-8实验结果显示:DCs-vac细胞在20μg/ml浓度的Tara中培养时即出现生长抑制(P<0.05),且随着Tara浓度的增加,DCs-vac的CD80、CD86表达呈下降趋势(P<0.05),但是Tara对MHCII的表达变化无明显影响(P>0.05)。肿瘤局部DCs浸润情况IF结果显示:PBS组与Tara组肿瘤浸润的DCs没有显著差别(P>0.05);同时,在DCs组和DT组中,CD45.1~+DCs在肿瘤局部存在浸润,但无显著差别(P>0.05)。提示:Tara在体外不能进步促进DCs-vac增殖活化,在体内也不能促进DCs生长及浸润至肿瘤局部。6.模型肿瘤局部细胞凋亡结果显示:相较于PBS组,Tara组和DCs组中凋亡细胞比例皆增加(P<0.05),但与其他三组相比,DT组肿瘤组织坏死凋亡面积最大,凋亡细胞最多(P<0.01)。FCM检测LLCs凋亡显示:Tara处理LLCs 48h后早凋细胞约占4%,晚凋细胞约占5%,提示其仅有轻微的促凋效应(P<0.05),这似乎并不足以解释体内DT组肿瘤局部显著的凋亡现象。7.体外CTLs杀伤实验结果显示:MACS分选CD8~+T细胞阳性率达到92%;PI染色和镜检分析LLCs凋亡情况:随着CTLs:LLCs比率的增加,LLCs更明显地被CTLs杀伤,细胞皱缩破碎,凋亡漂浮细胞团显著增多;重要的是,相较于对照组,经Tara预处理组的LLCs凋亡率显著增加(P<0.05),提示Tara可显著增强LLCs的杀伤敏感性。IF共定位结果提示:各组肿瘤组织凋亡细胞可能与CD8~+T细胞杀伤作用相关(P<0.05)。并且结合分析各组RNA-seq数据发现,DT组肿瘤的凋亡现象和肿瘤细胞焦亡、自噬和铜死亡途径并不显著相关。8.各组肿瘤样本RNA-seq结果:提取padj<0.05及log2 Fold Change>2的基因得到:与PBS组相比,Tara组有612个上调基因,866个下调基因;DCs组有967个上调基因,595个下调基因;DT组有679个上调基因,922个下调基因。KEGG富集分析后发现以ECM(extracellular matrix)-受体相互作用途径变化最为显著。Venn分析各治疗组相比PBS组时,ECM-受体相互作用途径中差异表达基因结果显示:与I型胶原蛋白(type I collagen,Col I)和肌腱蛋白相关的4个共同下调基因:即Col1a1(I型胶原蛋白α1,collagen,type I,alpha 1),Col1a2(I型胶原蛋白α2,collagen,type I,alpha 2),Tnn(肌腱蛋白N,tenascin N)和Tnc(肌腱蛋白C,tenascin C)。进一步分析RNA-seq结果中ECM-受体相互作用途径相关基因表达倍数变化结果显示:CD36,CD44,Col1a1,Col1a2,Lamc2(层粘连蛋白γ2,laminin,gamma 2),Spp1(骨桥蛋白,secreted phosphoprotein 1),Thbs1(血小板反应蛋白1,thrombospondin 1)和Tnn,Tnc等多个ECM重要基因的表达在Tara组肿瘤中均有下降趋势。Real-time RT-PCR验证结果显示:Tara体外处理LLCs中CD44,Col1a1,Col1a2,Itga7,Spp1,Thbs1,Tnc的m RNA水平明显下调(P<0.05)。体内肿瘤组织中,与PBS组相比,Tara组和DT组肿瘤组织中CD44,Col1a1,Itga7(整合素α7,integrin alpha 7),Spp1,Sdc4(多配体蛋白聚糖4,syndecan 4)的m RNA水平明显下调(P<0.05),DCs组肿瘤中CD44,Col1a2,Itga7,Lamc2,Sdc4,Spp1,Thbs1的表达显著上调(P<0.01),仅Tnc表达降低(P<0.01)。WB结果进一步显示:与对照组相比,体外经Tara处理的LLCs中的Col1a1和Col1a2蛋白水平显著下调(P<0.05)。IF结果显示:体外经Tara处理后LLCs细胞中Col I的表达量显著减少(P<0.01);体内肿瘤中也得到一致结果,即相较于PBS组,Tara组和DT组肿瘤组织中Col I的表达量显著下调(P<0.01)。9.CCK-8实验、划痕实验、克隆形成实验结果分别显示:与对照组相比,Tara处理LLCs的增殖、迁移能力和克隆形成能力均显著降低(P<0.05);鬼笔环肽染色结果显示:对照组LLCs呈明显的EMT,细胞簇集落生长迁移,具有明显的细胞-细胞间粘附;而Tara处理后的LLCs生长稀疏,细胞形态较圆;周期分析结果显示:与对照组相比,Tara组LLCs细胞G0/G1期比例明显上调(P<0.01),S期和G2/M期细胞比例显著下调(P<0.01)。IF结果显示:Tara体外处理LLCs中Ki-67表达明显下调;类似地,各治疗组中肿瘤细胞的Ki-67表达显著下调(P<0.05),且DT组下调最为显著。Real-time RT-PCR结果显示:较对照组,Tara处理LLCs中CDK4、CDK6、MMP2、MMP3、MMP9的m RNA水平显著下调(P<0.01)。WB结果进一步显示:CDK4、CDK6、cyclin B1、p53、MMP2、MMP3、N-cadherin、Vimentin表达水平明显减低(P<0.05),这与Real-time RT-PCR结果相一致。此外,肿瘤组织Real-time RT-PCR检测结果显示:较PBS组,各治疗组肿瘤组织中CDK3、CDK4、CDK6、MMP3、MMP9的m RNA水平显著下调(P<0.01),且DCs组和DT组肿瘤中CDK1、MMP2也被下调(P<0.05)。Tara可以在体内外下调肿瘤细胞生长、转移相关基因表达。10.靶点预测结果显示:Tara的潜在靶点共得到625个靶分子,筛选去重后得到465个鼠源基因,然后与筛选到的15542个小鼠源肺腺癌相关基因venn分析得到420个交集。通过DAVID数据库对Tara和小鼠NSCLC的420共同靶点进行功能注释,在条形图显示了FDR≤0.001的BP、CC和MF前15条通路主要包括:BP:脂质代谢过程,药物反应,蛋白质磷酸化,缺氧反应等;MF:转移酶活性,类固醇结合,蛋白激酶活性,跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG富集气泡图中富集了Tara潜在影响小鼠NSCLC的前45条通路主要与:代谢途径,癌症途径,癌症蛋白聚糖通路,血管内皮生长因子信号通路等相关。degree排名前30个Tara和鼠源LUAD相关的共同靶点分子对接结果显示结合能皆小于-7 kcal/mol,提示该30个靶分子都能与Tara自由结合。接着我们查阅文献,选取了影响ECM途径的主要5个候选分子:GSK3β(糖原合成酶激酶3β,Glycogen synthase kinase 3 beta),SRC(肉瘤癌基因,Rous sarcoma oncogene),AKT2(胸腺瘤病毒原癌基因2,Thymoma viral proto-oncogene 2),JAK2(Janus激酶2,Janus kinase 2),PIK3R1(磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1,Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1)。这5个Tara候选靶分子主要富集途径包括:Focal adhesion,PI3K/AKT,JAK/STAT,m TOR等信号通路。FCM和WB结果显示:经过Tara处理后LLC中pan-AKT、p-AKT、p-PIK3R1、JAK2、p-JAK2表达水平显著下调(P<0.05),p-GSK3β表达增加(P<0.05),但是GSK3β、PIK3R1的表达没有显著变化(P>0.05)。提示Tara可能通过结合PIK3R1和AKT2,并抑制其磷酸化,来影响ECM通路。WB进一步检测此5个靶分子所在信号通路上下游分子变化,结果显示:Tara处理后LLCs中α-SMA,STAT3,p-STAT3,FAK,m TOR,p-m TOR的表达显著下调(P<0.05)。各组肿瘤组织IF结果进一步显示:Tara组和DT联合组的肿瘤中p-AKT,p-PIK3R1的表达显著下调(P<0.01)。Tara和PIK3R1和AKT2对接可视化结果显示:Tara可以通过与PIK3R1的346号位懒氨酸形成氢键;也可以与AKT2的178号位的酪氨酸形成作用力而结合。提示Tara可能通过下调PI3K/AKT/m TOR通路来影响ECM途径,并抑制LLCs生长转移。11.H&E染色结果显示:PBS组,Tara组模型脏器没有明显病理学改变;DCs组中Dolutegravir供应商DCs-vac所导致的炎症风暴明显引起模型小鼠心、肝、肾等组织结构改变,但在DT组中Tara似乎能减少炎性反应带来的脏器炎性损伤,明显改善DT组模型中由DCs-vac引起的脏器病变;这与外周血中IFN-γ和TNF-α水平检测结果相一致,相较于PBS组,DCs组小鼠血清IFN-γ和TNF-α含量明显升高(P<0.01),但相较于DCs组,DT组的IFN-γ和TNF-α显著下调(P<0.05);此外,各治疗组血清IL-10含量明显低于PBS组3倍的以上(P<0.01)。结论:1.Tara能提高DCs-vac抗小鼠NSCLC的治疗效果,并改善DCs-vac诱发的炎症反应。2.Tara提高DCs-vas抗瘤效应机制,与其靶向PIK3R1和AKT2分子,影响PI3K/AKT/m TOR/ECM通路,从而减少I型胶原蛋白的生成,导致肿瘤细胞对CTLs的杀伤敏感性增加有关。