草原龙胆(Eustoma grandiflorum)属于龙胆科(Gentianaceae)草原龙胆属(Gentian)草本植物,具有较高的观赏价值。但目前国内草原龙胆栽培品种主要以日本、欧美的F_1代杂交种为主,我国拥有自主知识产权的品种少,一些特殊花色类型,如双色花更为稀缺,严重制约了我国草原龙胆产业的长远发展。本研究利用传统育种手段,创制了6个遗传性稳定的优良双色花自交系,并通过UPLC-MS技术和高通量测序技术对双色花自交系MT1花瓣发育过程中的次生代谢物和差异基因的表达进行了分析,为阐明草原龙胆双色花形成中花青素积累的分子机制奠定了基础,为草原龙胆种业创新提供了思路和技术支撑。研究结果如下:1.创制了6个拥有自主知识产权的草原龙胆双色花自交系。选择24个白色单瓣母本与5个红色单瓣父本进行杂交,配置了24个杂交组合,其中15个组合为全色花,剩余9个组合中出现不同比例的双色花类型,但是比例较小。进一步对9个组合中的双色花进行评价,鉴定到6个较优良的双色花组合,经过MG132核磁6代连续自交获得近纯合的双色花自交系MT1、MT2、MT3、MT4、MT5、MT6,其中MT1、MT2着色部位为条状类型,MT5、MT6着色部位为点状类型,其它两个自交系着色部位属于中间类型。对这6个自交系的农艺性状、花器官特征、自交结实情况进行评价,鉴定到MT1的综合性状优势最强,作为下一步分析研究的试材。2.在草原龙胆双色花花瓣不同部位比较中鉴定到3种花青素苷,观察发现着色部位不同组织中均有色素分布。对双色花自交系花瓣组织的色素分布进行了观察,发现花瓣着色部位不同组织中均有色素分布,上表皮及紧贴上表皮的栅栏组织中色素多于下表皮,未着色部位组织没有色素分布。利用UPLC-MS技术对双色花花瓣发育的不同时期及不同部位进行了次生代谢物检测。通过花瓣发育不同时期着色部位分析,鉴定到5种花青素苷,分别为矢车菊素3-(3”,6”-二甲酰基)葡萄糖苷、矢车菊素3-(对香豆酰)芸香苷-5-葡萄糖苷、飞燕草素5-葡萄糖苷3-桑布双糖苷、飞燕草素3-葡萄糖苷5-咖啡酰葡萄糖苷、飞燕草素3-O-(6-对咖啡酰)葡萄糖苷。通过比对S3时期花瓣着色部位与未着色部位,鉴定到3种花青素苷,分别为天竺葵素3-葡萄糖苷5-(6-香豆酰)葡萄糖苷、芍药色素3-(对香豆酰)芸香苷-5-葡萄糖苷、飞燕草素3-O-(6-对咖啡酰)葡萄糖苷。3.筛选到差异表达的结构基因25个,MYB转录因子5个,b HLH转录因子2个。对草原龙胆双色花发育的四个时期及花瓣上下部位样品进行RNA-Seq分析。S3时期花瓣上下部位比较的差异表达基因富集到类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成途径,这两个途径与花瓣色素积累有直接关系;进一步对花青素生物合成途径相关的结构基因进行分析,共筛选到25个差异表达的结构基因,其中Eg CHS1基因在花瓣着色部位的表达量是未着色部位的21.5倍;通过构建进化树,发现有5个MYB和2个b HLH与拟南芥花青素生物合成相关的转录因子聚为一类。4.挖掘到Eg CHS1基因在双色花色素积累过程中起重要作用。进行了花青素生物合成途径Taxus media相关的差异代谢物与差异表达基因的联合分析,绘制了二者的聚类热图与网络图,挖掘了网络调控中关键基因与代谢物的关联性,发现基因Eg CHS1关联到代谢物飞燕草素3-O-(6-对咖啡酰)葡萄糖苷,且二者呈正相关,飞燕草素3-O-(6-对咖啡酰)葡萄糖苷是花色形成的主要色素,Eg CHS1基因可能在飞燕草素3-O-(6-对咖啡酰)葡萄糖苷的生物合成过程中起到一定的促进作用。最后构建了双色花形成过程中色素积累的模型图。5.Eg CHS1基因在花瓣着色部位表达量显著高于其它组织中,可能是导致双色花形成的关键基因。克隆了草原龙胆双色花Eg CHS1基因,其编码区长度为1167bp,编码389个氨基酸。构建进化树发现草原龙胆Eg CHS1蛋白与圆叶牵牛的CHS蛋白聚成一支,说明亲缘关系最近。分析发现Eg CHS1蛋白为稳定的亲水蛋白,亚细胞定位在细胞质中。Eg CHS1基因在花瓣着色部位表达量最高,在花瓣未着色部位、selleck激酶抑制剂茎、叶、根部表达量较低,Eg CHS1可能是草原龙胆双色花形成过程中的重要基因,这为双色花形成机理研究提供了新的思路。