研究目的:体内脂质平衡失调及氧化应激导致三酰甘油在肝细胞内严重储积,引起肝细胞中非酯化游离脂肪酸大量聚集进而加剧肝脏脂质沉积,导致肝脏脂肪变性形成非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),进而发展为肝脏纤维化。Nrf2/HO-1信号通路被认为是对抗氧化应激的主要细胞防御机制,可通过调控抗氧化基因HO-1的表达导致细胞氧化还原状态的恢复,促进细胞恢复抗氧化能力,从而改善氧化应激水平。运动是治疗非酒精性脂肪肝的有效手段。本文探究自主跑轮运动通过调节核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1通路(Nrf2/HO-1)调控肝脏氧化应激,缓解HFFC膳食诱导的肝脏纤维化进程,延缓NAFLD发生发展,为运动防治NAFLD的生物学机制提供科学理论依据,寻求NAFLD干预治疗新策略。研究方法:将30只雄性C57BL/6J小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2018-0027)适应性饲养1周后,其中10只给予普通膳食饲养,为普通饮食组(NC组,n=10),剩余20只给予高脂肪、果糖和胆固醇膳食(High fat, fructose and cholesterol diet, HFFC含40%脂肪,20%果糖和2%胆固醇美国Research Diets公司#D09100301)饲养,为高脂肪、果糖和胆固醇饮食组(HFFC组,n=20)。所有小鼠自然光照,室内温度为20±5°C,自由获得水和食物。动物饲养条件以及操作严格按照实验动物的标准进行。饲养10周后,将高脂肪、果糖获悉更多和胆固醇饮食组小鼠分为安静组(HFFC组,n=10)和高脂肪、果糖和胆固醇饮食结合运动干预组(HFFC+EX组,n=10)。小鼠单笼饲养,其中运动干预组小鼠鼠笼中装有自主跑轮供小鼠自由活动,自主跑轮连接磁感应累加计数器,小鼠每跑一圈附着在自主跑轮上的磁铁接近感应开关0～4mm再离开30mm以上,即为完成一次计数,其计数频率可达10次/每秒,保证计数的准确性,隔日固定时间进行跑轮圈数的记录与清零,用跑轮圈数乘以跑轮周长计算得到每日小鼠转轮跑步距离,连续干预8周。自主跑轮的跑步模式与小鼠的自然跑步行为相似,运动根据小鼠的节奏自主进行,小鼠运动训练不需要研究者的直接干扰,易应用于长期研究。本研究中,小鼠平均每天跑轮运动距离为6～11公里,达到自主跑轮运动标准。末次运动干预结束后间隔24小时,禁食12小时处死小鼠,取小鼠血液及肝脏组织等样本进行相关实验检测。其中,血液用于检测血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT),反映肝脏的损伤程度;新鲜肝脏组织制作石蜡样本和冰冻样本用于免疫组织学染色观察肝脏病理形态(HE染色、油红染色、天狼星红染色、Masson染色)。冻存肝脏样本用于检测肝脏甘油三酯(triglycerides,TG)含量和氧化应激标志物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)活性,反映肝脏脂质沉积、脂质过氧化水平及抗氧化能力;免疫蛋白印迹法(Western blotting)测定氧化应激相关抗氧化基因表达水平(Nrf2、HO-1)观察肝脏细胞氧化应激水平。研究结果:(1)与普通膳食组相比,HFFC膳食诱导的肥胖小鼠的肝指数及血清谷草转氨酶3-Methyladenine和谷丙转氨酶(AST、ALT)水平显著升高(P<0.01),HFFC膳食小鼠经8周自主跑轮运动干预后肝指数及血清转氨酶(AST、ALT)水平显著下降(P<0.01)。(2)与NC组相比,HFFC组小鼠肝脏甘油三酯(TG)含量显著升高(P<0.05);HE染色可见HFFC膳食小鼠肝脏存在大量脂肪空泡;油红染色显示高脂肪、果糖和胆固醇饮食组小鼠肝脏橘红色脂滴面积显著增大(P<0.01),经8周自主跑轮运动干预后小鼠肝脏甘油三酯(TG)含量显著下降(P<0.05),肝脏脂肪空泡含量减少,肝细胞胞浆中脂滴含量减少,肝细胞结构较为清晰,橘红色脂滴面积显著减少(P<0.01)。(3)与普通膳食组相比,HFFC膳食组小鼠氧化应激标志物丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.01),氧化应激标志物超氧化物歧化酶和总抗氧化能力(SOD、T-AOC)活性呈下降趋势,经过8周自主跑轮运动干预后HFFC膳addiction medicine食组小鼠的氧化应激标志物超氧化物歧化酶和总抗氧化能力(SOD、T-AOC)活性显著增加(P<0.05),氧化应激标志物丙二醛(MDA)含量呈下降趋势。(4)与NC组相比,天狼星红染色显示HFFC膳食组小鼠肝脏红色胶原纤维显著增多(P<0.01),Masson染色显示高脂肪、果糖和胆固醇饮食组小鼠的肝脏组织蓝色胶原纤维沉积显著增加(P<0.01),经过8周运动干预后肝脏组织胶原纤维沉积显著减少(P<0.05)。(5)与普通膳食组相比,HFFC膳食组的小鼠肝细胞抗氧化应激转录因子Nrf2表达水平显著下降,抗氧化基因HO-1显著上升(P<0.01),经过8周自主跑轮运动干预后,运动组小鼠的Nrf2和HO-1的基因表达水平均显著上升(P<0.05)。研究结论:(1)18周高脂肪、果糖和胆固醇膳食可诱导小鼠肝脏脂质沉积加重,导致肝脏氧化应激增高,抗氧化应激转录因子Nrf2表达水平下降,而抗氧化基因HO-1表达水平出现代偿性上升,伴随出现肝脏纤维化。(2)8周自主跑轮运动干预可显著改善长期HFFC膳食引起的肝组织过氧化损伤程度,通过上调抗氧化基因Nrf2及下游抗氧化基因HO-1水平改善肝组织氧化应激,促进肝细胞恢复抗氧化能力,改善肝脏氧化应激水平,缓解肝脏纤维化进程。