短双歧杆菌亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase,BBI)是乳酸菌中单酶催化生成顺9,反11-共轭亚油酸单体(c9,t11-CLA)的亚油酸异构酶。作为一种具有九次跨膜结构的膜结合蛋白,BBI在原始菌中表达量极低,导致该酶的结构与功能关系研究变得困难,也限制了其进一步开发应用。本文通过比较BBI在模式微生物大肠杆菌和毕赤酵母中的表达水平差异,确定了BBI在两种表达系统中的适用范围,并在此基础上建立BBI的纯化流程,开展了酶动力学研究,同时预测和验证了该酶的活性位点,这些研究结果为该酶的进一步开发应用打下了坚实的基础。本文的主要研究结果如下:(1)膜结合型亚油酸异构酶BBI表达系统的优化与适用范围的确定。对大肠杆菌BBI的表达宿主、标签位置、诱导条件进行优化,确定最佳表达条件为:羧基端融合His标签的BBI在E.coli Rosetta菌株中进行表达,以1.0 mmol/L的IPTG诱导8 h。比较BBI在大肠杆菌和毕赤酵母系统中的蛋白表达水平,分析后确定利用毕赤酵母系统表达BBI并进行后续纯MLN8237研究购买化研究,利用大肠杆菌系统进行BBI的功能验证。(2)膜结合型亚油酸异构酶BBI纯化流程的构建。为实现九次跨膜的膜结合型蛋白BBI的高效分离和提取,首先进行膜组分分离条件的优化,确定10000 g、1 h作为膜组分富集的条件;接着通过对离子型、非离子型和两性离子型在内的10种去垢剂进行筛选,确定2%(w/v)的十二烷基-β-D-麦芽糖苷、4°C孵育2 h作为BBI的提取条件;最后联用亲和层析和凝胶分离层析,获得了分子量约为40 k Da的电泳纯BBI,比酶活为17.44μmol·min~(-1)·mg~(-1),纯化约669.54倍。(3)膜结合型亚油酸异构酶BBI酶学性质的研究。BBI纯酶的最适作用温度为37°C,最适p H为7.5～8.5,在37°C时半衰期为32.24 min,在p H 7.5～8.5范围内可以维持较高的催化活性。Ni~(2+)和Zn~(2+)可将BBI的酶活性提升至150%～160%,而Cu~(2+)、Fe~(2+)、Al~(3+)使BBI活力基本丧失。当以亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸为底物时,BBI与γ-亚麻酸亲和度最高,其Km值为125.89 mg/L,k_(cat)/K_m值大小依次为α-亚麻酸、亚油酸和γ-亚麻酸,BBI对α-亚麻酸的催化效率最高。(4)膜结合型亚油酸异构酶BBI活性位点的预测与验证。基于蛋白结构模拟、分子对接和虚拟突变技术,分别构建了片段截短和点突变的重组菌进行验证。研究结果显示截去氨基端跨膜螺旋可能会造成BBI三维结构发生不利变化,影响其催化活性;截去羧基端跨膜螺旋可能导致BBI无法定位到膜上或者无法正确组装。活性空腔远端的跨膜螺旋结构对于BBI的活性构象,具有同样重要的作用。进一步利用分子对接模拟氨基酸突变前后的能量变化,利用大肠杆菌表达系统筛选了潜在的活性位点,通过毕赤酵母表Sickle cell hepatopathy达系统对潜在活性位点进行AMG510验证,最终确认了Y205为关键氨基酸残基,同时筛选获得了一株Y205M突变体株可使BBI相对酶活性提升至111%。