急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是指冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死,是心血管疾病中主要的死亡原因。《中国心血管病报告2021》公布数据显示,我国心血管患病率及死亡率仍处于上升阶段,心血管病现患病人数2.9亿,心血管死亡占居民疾病死亡构成的40%以上。近年来AMINaporafenib发病率呈明显上升趋势,每年新发至少50万,现患至少200万。尽管介入和溶栓技术广泛开展,但仍然难以避免AMI后心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)发生。MF发生后难以逆转,是导致AMI后心功能降低的主要原因,是影响AMI远期预后的世界性难题。目前临床用于延缓AMI后MF的药物包括肾素-血管紧张素-醛固酮(rein-angiotensin-Aldosterone-system,RAAS)系统阻断剂、Ca2+通道阻滞剂、血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂等。目前对AMI后MF的发病机制认识包括RAAS系统度激活、氧化应激和炎症因子损害心肌、细胞外基质过度沉积、心肌成纤维细胞过度增殖等。然而AMI后MF病理机制复杂,亟待进一步阐明AMI后MF的发病机制,寻找更多干预药物和治疗靶点,这对提高AMI患者远期预后,降低AMI后MF的发病率与死亡率具有重要的临床价值。MF的主要特征为成纤维细胞积聚,引起细胞外基质过度沉积,导致心室壁僵硬、组织顺应性降低和心脏舒缩功能不全。其主要来源于常驻成纤维细胞、骨髓源性纤维细胞、上皮细胞间质转分化和 内 皮 细 胞(Endothelial cells,ECs)间 质 转 分 化(Endothelial-tomesenchymal transition,EndMT)。其中内皮间质转分化是MF的重要来源之一,约占20至30%。传统中医学认为本病病机属本虚标实,以气虚为本,瘀血、痰浊为标。中医脉络学说提出AMI后心肌纤维化“气虚血瘀,络塞积成”病机特点和“益气活血,通络消积”治法。因此,本研究以“内皮间质转分化”为切入点,围绕神经调节蛋白-1(Neuregulin-1,NRG-1)介导的EndMT在AMI后心肌纤维化中的作用机制,应用C57BL/6小鼠建立AMI致EndMT模型,采用注射腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)方法对 NRG-1 过表达和敲低,观察 NRG-1及其下游通路介导EndMT在AMI后心肌纤维化中的作用机制。结合治法,分别以益气通络之人参、活血化瘀之丹参、化瘀通络之水蛭及通络代表药物通心络作为干预药物,探讨通络药物调控NRG-1介导的EndMT在心肌纤维化中的作用及机制,佐证“气虚血瘀,络塞积成”病机假说,开辟通络药物阻抑AMI后心肌纤维化的有效治疗途径。第一部分 NRG-1调控内皮间质转分化在急性心肌梗死后心肌纤维化中的作用机制研究目的:探索NRG-1在EndMT介导的AMI后心肌纤维化中的作用机制。方法:选用C57BL/6小鼠,随机分为5组:假手术组(Sham)、模型组(Model)、NRG-1 过表达组(NRG-1 OE)、NRG-1 敲低组(NRG-1 KD)、阴性对照组(NC)。结扎小鼠冠状动脉左前降支建立AMI模型,使用AAV原位注射方法对AMI小鼠心脏NRG-1基因进行过表达和敲低。4周后称量小鼠心脏重量和体重,计算心脏指数以评价心肌肥厚程度;使用小动物超声仪检测小鼠心功能;HE染色、Masson染色评估心肌细胞形态及心肌纤维化情况;免疫组化检测Collagen Ⅰ,CollagenⅢ以评估胶原蛋白表达情况;使用免疫荧光方法检测CD31、α-SMA以观察EndMT情况;蛋白印迹分析方法(Western blot)检测 CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP-1及NRG-1下游PI3K/AKT通路蛋白。探索NRG-1是否通过抑制EndMT改善AMI后MF。结果:1.AMI造模前后心电图改变及心脏形态变化造模前心电图为窦性心律,无ST段抬高。显微镜下观察小鼠心脏形态,心脏色泽鲜红,收缩舒张有力。结扎冠状动脉左前降支后出现明显ST段弓背抬高及心律减慢。显微镜下观察,小鼠心脏色泽由鲜红变为苍白,收缩及舒张幅度均明显降低。2.各组小鼠心脏指数比较与Sham组比较,Model组小鼠心脏指数升高(P<0.01),提示心肌肥厚明显。与Model组比较,NRG-1敲低组心脏指数升高(P<0.01),提示心肌肥厚程度加重;NRG-1过表达组心脏指数降低(P<0.05),提示心肌肥厚程度减轻;NC组无显著性差异(P>0.05)。3.各组小鼠心功能比较心脏超声结果显示:与Sham组比较,Model组和NC组小鼠均有心室壁变薄、室壁运动不协调等改变,射血分数显著降低(P<0.01)。与Model组比较,NRG-1 OE组射血分数降低(P<0.01),NRG-1 KD组射血分数降低(P<0.05),NC组无明显变化(P>0.05)。4.各组小鼠心肌纤维化情况Masson染色结果显示:Sham组心肌组织纤维排列紧密有序,无明显胶原纤维增生;与Sham组比较,Model组心肌纤维排列无序,胶原纤维面积显著增加(P<0.01)。与Model组比较,NRG-1 OE组后胶原纤维面积减少(P<0.01);NRG-1 KD组胶原纤维面积增大(P<0.01),同时伴有心肌细胞变形和减少;NC组无明显差异(P>0.05)。免疫组化检测Collagen Ⅰ,CollagenⅢ结果与 Masson 结果一致。5.各组小鼠AMI后EndMT相关蛋白CD31,α-SMA表达情况免疫组化检测CD31和α-SMA结果显示:与Sham组比较,Model组心脏微血管CD31表达减少(P<0.01),α-SMA表达增加(P<0.01)。与Model组比较,NRG-1 OE组CD31表达增加(P<0.01),α-SMA表达减少(P<0.05);NRG-1 KD 组 CD31 表达减少(P<0.01),α-SMA 表达增加(P<0.01);NC组无明显变化(P>0.05)。Western blot检测结果与组化结果一致。6.各组小鼠NRG-1及其下游PI3K/AKT通路蛋白表达情况Western blot检测NRG-1及其下游PI3K/AKT通路蛋白。结果表明:与Sham组比较,AMI后NRG-1、PI3K和p-AKT的蛋白水平显着降低(P<0.05)。与 Model 组比较,NRG-1 OE 组NRG-1、PI3K 和 p-AKT 蛋白表达增加(P<0.05);NRG-1 KD组NRG-1、PI3K和p-AKT蛋白表达降低(P<0.05);NC组无明显差异(P>0.05)。小结:本研究表明EndMT参与AMI后MF形成,NRG-1通过激活下游PI3K/AKT通路抑制EndMT,从而改善AMI后MF,NRG-1是关键靶点。第二部分 益气活血通络药物在AMI后心肌纤维化中的作用及机制研究目的:揭示益气活血通络药物对AMI后MF的干预作用及机制。方法:实验一:造模方法同第一部分,随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、TXL 组(TXL)、TXL+NRG-1 敲低组(TXL+NRG-1 KD)、阴性对照组(NC)。Sham组、Model组和阴性对照组以等量羧甲基纤维素钠溶液灌胃。4周后,称取心脏重量、记录并计算心脏指数;使用心脏超声评价心功能;Masson染色方法检测心肌纤维化程度;免疫组化方法检测Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的蛋白表达水平,免疫荧光方法检测CD31、α-SMA;Western blot检测CD31、α-SMA及NRG-1下游PI3K/AKT通路蛋白。实验二:造模方法同第一部分,随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、人参皂苷Rg1组(RS)、丹参酮ⅡA组(DS)、水蛭素组(SZ)、人参皂苷Rg1+丹参酮ⅡA组(RS+DS)、人参皂苷Rg1+水蛭素组(RS+SZ)、TXL组(TXL)、贝那普利组(Benazepril)。灌胃药物浓度:人参皂苷Rg1 20mg/kg/d,丹参酮ⅡA 20mg/kg/d,水蛭素20mg/kg/d,TXL 0.75 g/kg/d,贝那普利 10mg/kg/d。灌胃给药 4 周后,称取心脏重量、体重,记录并计算心脏指数;使用心脏超声评价心功能;Masson染色方法检测心肌纤维化程度;免疫荧光方法检测CD31、α-SMA表达。通过以上方法评价益气、活血、通络药物对AMI后MF的作用。探索通络代表药物通心络是否通过抑制EndMT对AMI后MF及的作用及机制。结果:实验一;1.各组小鼠心脏指数比较与Sham组比较,Model组小鼠的心脏指数显著升高(P<0.01);与Model组比较,TXL组心脏指数显著降低(P<0.01);TXL+NRG-1 KD组无明显变化,NC组无明显差异(P>0.05)。2.各组小鼠心功能比较心脏超声结果显示:与Sham组比较,Model组射血分数显著降低(P<0.01);与Model组比较,TXL组射血分数有明显改善提高(P<0.01),TXL+NRG-1 KD组无明显变化,NC组无明显差异(P>0.05)。3.各组小鼠AMI后MF情况Masson染色结果显示:Sham组心肌组织无明显胶原纤维增生;与Sham组相比,Model组出现大量胶原纤维增生(P<0.01),以心尖部最为明显;与Model组比较,TXL组心肌纤维化程度明显减轻(P<0.01);TXL+NRG-1 KD组无明显变化;NC组无明显差异(P>0.05)。免疫组化检测 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ与 Masson 结果一致。4.各组小鼠AMI后EndMT相关蛋白CD31,α-SMA表达情况免疫荧光结果提示:在Sham组中,CD31在血管内皮中广泛表达,而α-SMA仅在血管壁中轻微表达。与Sham组比较,Model组CD31表达下调(P<0.01),α-SMA表达上调(P<0.01)。与模型组相比,NC组无明显差异;通心络组CD31表达上调(P<0.01),α-SMA表达下调(P<0.01);TXL+NRG-1 KD组无明显差异(P>0.05)。表明TXL能够抑制AMI后心肌纤维化小鼠EndMT进程,而通心络的保护作用被NRG-1敲低所减弱。Western blot检测CD31和α-SMA,与免疫荧光结果一致。5.Biochemical alteration各组小鼠NRG-1及下游PI3K/AKT通路蛋白表达情况Western blot检测显示:与Sham组比较,Model组NRG-1及其下游PI3K、p-AKT蛋白水平显着降低(P<0.05)。与Model组比较,TXL组NRG-1及其下游PI3K、p-AKT蛋白表达显着升高(P<0.05),TXL+NRG-1 KD组无明显变化(P>0.05);NC组无明显差异(P>0.05)。提示敲低NRG-1后可抵消通心络的保护作用。实验二:1.各组小鼠心脏指数比较与Sham组比较,Model组小鼠的心脏指数显著升高(P<0.01);与Model组比较,所有给药组心脏指数显著降低(P<0.05)与DS组比较,RS+DS两种单体联用、TXL组、Benazepril组对心脏指数降低更显著(P<0.05)三个单体之间比较无明显差异(P>0.05);与RS组比较,RS+DS、RS+SZ无明显差异(P>0.05);与SZ组比较,RS+DS、RS+SZ无明显差异(P>0.05);RS+SZ组、TXL组和Benazepril组之间无明显差异(P>0.05)。2.各组小鼠心功能比较心脏超声结果显示:与Sham组比较,Model组和NC组小鼠均有心室壁变薄、室壁运动不协调等改变,射血分数显著降低(P<0.01)。与Model组比较,各给药组对射血分数均有明显升高(P<0.05);与单用单体组比较,联用组效果更好,RS+DS组优于RS组和DS组(P<0.05),RS+SZ组优于RS组和SZ组(P<0.05);三个单体组之间无明显差异(P>0.05);RS+DS 组、RS+SZ 组、TXL 组、Benazepril 组之间无明显差异(P>0.05)。3.各组小鼠AMI后MF情况Masson染色结果显示:Sham组心肌细胞结构完整均匀,心肌组织纤维排列紧密有序,无明显胶原纤维增生。与Sham组相比,Model组心肌细胞数量略有减少并伴有心肌细胞形态改变,胶原纤维增多(P<0.01)。与Model组比较,各单体组、TXL组和Benazepril组均有改善(P<0.01),心肌结构趋于规则,胶原纤维增生范围减少;与RS、DS、SZ三个单体组相比,联用组RS+DS组、RS+SZ组的改善程度更为明显(P<0.05)。与RS+DS组比较,RS+SZ组、TXL组和Benazepril组改善程度更为明显(P<0.05)。4.各组小鼠AMI后EndMT相关蛋白CD31,α-SMA表达情况免疫荧光结果提示:Sham组CD31表达广泛,α-SMA仅在血管壁有少量表达;与Sham组相比,Model组CD31表达减少(P<0.01),α-SMA表达增多(P<0.01)。与Model组相比,各单体组、TXL组和Benazepril组CD31表达增加(P<0.05),α-SMA表达减少(P<0.01);与三个单体组相比,联用组的CD31表达增加(P<0.05),α-SMA表达减少(P<0.05)。与RS+DS组比较,RS+SZ组、TXL组和Benazepril组CD31表达增加(P<0.05),α-SMA 表达减少(P<0.05)。小结:以中医脉络学说为指导,提出AMI后MF的基本病机为“气虚血瘀,络塞积成”,并确立“益气活血,通络消积”治法。益气活血通络代表方通心络可通过抑制EndMT改善AMI小鼠的心功能和心肌纤维化情况,机制可能与激活NRG-1及其下游PI3K/AKT通路有关。益气、活血、通络中药单体对AMI后心功能均有改善作用,但水蛭素干预MF的效果优于人参皂苷Rg1和丹参酮ⅡA,可能与水蛭素抑制EndMT的作用有关。单体联用优于MS-275生产商单体单用,而且益气通络组合优于益气活血组合。通心络优于益气活血单体组合,与益气通络单体组合作用相当。在本病治疗中益气通络发挥更有利的作用,揭示通络药物不同于一般活血化瘀药物,可深入络脉,达到通络消积的目的。本研究进一步佐证了“气虚血瘀,络塞积成”的病机假说,为脉络学说指导的“益气活血,通络消积”治法提供科学数据和佐证。而益气通络单体组合抑制EndMT具体作用机制是否与激活NRG-1及其下游通路蛋白有关,仍有待深入探讨。第三部分 益气通络中药单体组合在AMI后心肌纤维化中的作用研究目的:揭示益气通络中药单体组合对AMI后MF的干预作用及机制。方法:造模方法同前,造模后将小鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、益气通络单体组合组(RS+SZ)、益气通络单体组合+NRG-1 敲低组(RS+SZ+NRG-1 KD)、对照组(NC)。RS+SZ 组和RS+SZ+NRG-1 KD组给药浓度为:人参皂苷Rg1 20mg/kg/d+水蛭素20mg/kg/d,Sham组、Model组、NC组予羧甲基纤维素钠等体积灌胃。4周后使用小动物超声仪评价心功能;称取心脏重量、记录并计算小鼠心脏指数;Masson染色方法检测小鼠心肌纤维化程度;免疫荧光方法检测CD31和α-SMA的蛋白表达情况,通过以上方法评价益气通络单体组合对AMI后MF的作用,揭示益气通络单体组合在AMI后MF中的作用机制。结果:1.各组小鼠心脏指数比较与Sham组比较,AMI后心脏指数增大(P<0.01);与Model组比较,RS+SZ组心脏指数降低(P<0.05);RS+SZ+NRG-1 KD组、NC组无明显差别。2.各组小鼠心功能比较与Sham组比较,Model组和NC组均有心室壁变薄、室壁运动不协调等改变,小鼠的射血分数显著降低(P<0.01);与Model组比较,RS+SZ组射血分数显著升高(P<0.01);RS+SZ+NRG-1 KD组、NC组无明显差异(P>0.05)。3.各组小鼠AMI后MF情况Masson结果显示:Sham组心肌组织纤维排列紧密有序,无明显胶原纤维增生;与Sham组比较,Model组心肌纤维排列无序,胶原纤维显著增生(P<0.01);与Model组比较,NC组无明显差异;予单体组合后纤维增生程度减轻、面积减少(P<0.01);敲低NRG-1后抵消单体组合的作用(P>0.05)。胶原蛋白组化提示,Sham组collagen仅在血管壁有少量表达;与Sham组比较,Model组collagen表达上调(P<0.01);与Model组比较,单体组合组collagen表达下调(P<0.01);NC组无明显差异。敲低NRG-1可抵消单体组合的作用(P>0.05)。4.各组小鼠AMI后EndMT相关蛋白CD31,α-SMA表达情况免疫荧光结果显示,在Sham组中,CD31在血管内皮中广泛表达,而α-SMA仅在血管壁中轻微表达。与Sham组比较,Model组CD31表达下调,α-SMA表达上调。与模型组相比,NC组无明显差异;单体组合组CD31 表达上调(P<0.01),α-SMA 表达下调(P<0.01);敲低 NRG-1后可抵消RS+SZ的作用(P>0.05)。小结:人参皂苷Rgl和水蛭素的中药单体组合可以改善AMI后小鼠MF,其机制可能与激活NRG-1及抑制EndMT有关。结论:1.本研究以中医脉络学说为指导,提出AMI后MF的基本病机为“气虚血瘀,络塞积成”,并确立“益气活血,通络消积”治法。2.采用注射AAV的方式对AMI小鼠心脏NRG-1基因过表达和敲低,证实NRG-1通过激活下游PI3K/AKT通路参与抑制EndMT,减轻AMI后MF。3.通过应用益气活血通络代表方药通心络和“益气、活血、通络”药物单体进行干预,证实通心络可通过激活NRG-1及其下游PI3K/AKT通路,抑制EndMT,改善AMI小鼠MF和心功能。益气、活血、通络中药单体对AMI后心功能均有改善作用,但水蛭素通过抑制EndMT干预MF的效果优于人参皂苷Rgl和丹参酮ⅡA。单体联用抑制MF的作用优于单体单用,而且益气通络组合优于益气活血组合。通心络抑制MF的作用优于益气活血单体组合,而益气通络单体组合与通心络作用相当。在本病治疗中益气通络发挥主导作用,揭示通络药物是AMI后MF的有效治疗药物。4.益气通络单体组合通过激活NRG-1表达,抑制EndMT,从而改善AMI后小鼠MF,进一步佐证了“气虚血瘀,络塞积成”病机假说,揭示了通络药物干预EndMT发挥阻抑AMI后MF的作用和机制,为脉络学说指导的“益气活血,通络消积”治法提供科学数据,开辟通络药物干预AMI后MF的有效治疗途径。