目的:尿酸盐结晶(Monosodium urate crystals,MSU)沉积在局部组织、器官诱导炎症反应,引起痛风等相关疾病,已成为临床常见和多发病种。MSU引起的炎症应答与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体激活密切相关。既往研究显示,MSU通过诱导NLRP3炎症小体激活,促进IL-1β成熟、分泌,引起炎症效应。因此,阻断NLRP3炎症小体激活可能成为治疗MSU相关疾病的新策略。脂氧素A4(Lipoxin A4,LXA4)是人体内重要的内源性抗炎介质,能够对多种炎症细胞和炎症相关因子起到负性调节作用,缓解炎性病理损伤,被誉为炎症反应的“刹车信号”。然而,LXA4能否抑制MSU诱导的NLRP3炎症小体激活,目前尚未见报道。为此,本研究通过体内和体外selleck NMR实验验证LXA4干预MSU诱导的炎症反应,旨在探讨LXA4对MSU诱导的NLRP3炎症小体激活的抑制作用,并基于氧化应激反应、Nrf2信号通路研究其具体分子调控机制,期望为LXA4治疗MSU相关疾病提供理论依据。方法:1.构建MSU诱导NLRP3炎症小体激活的细胞模型体外培养THP-1、BMDM细胞,LPS作为第一信号预先诱导,然后MSU刺激细胞以激活NLRP3炎症小体,ELISA、Western blot测定炎症因子变化;2.探讨LXA4对NLRP3炎症小体激活的干预作用LXA4预先干预MSU诱导的NLRP3炎症小体激活模型,通过ELISA、Western blot、LDH释放率、细胞凋亡染色探讨LXA4对NLRP3炎症小体的干预效果;通过免疫荧光、免疫共沉淀分析LXA4对NLRP3炎症小体组装的影响;3.探讨LXA4对氧化应激干预作用通过特异性荧光探针检测总ROS及线粒体ROS、膜电位、钙离子水平,光泽精增强的化学发光法测定NADPH氧化酶活性;4.探讨LXA4是否通过干预Nrf2来抑制NLRP3炎症小体激活通过Western blot、免疫荧光检测Nrf2激活情况;利用Nrf2特异性激活剂激活Nrf2,检测LXA4对NLRP3炎症小体激活的抑制作用是否受到影响;采用分子对接、DARTS实验分析LXA4调控Nrf2的作用靶点;5.探讨LXA4对Nrf2/Klf9/TXNRD2的调控机制利用Western blot、PCR测定Klf9、TXNRD2表达,染色质共沉淀分析LXA4调控Nrf2/Klf9/TXNRD2的分子机制;6.探讨LXA4是否依赖于TXNRD2发挥功能利用小干扰RNA技术敲低TNXRD2,通过ELISA、Western blot、免疫共沉淀、特异性荧光探针染色等方法探究敲低TXNRD2对LXA4干预氧化应激、抑制NLRP3炎症小体激活有无影响;7.LXA4抑制NLRP3炎症小体激活的体内验证构建MSU诱导的急性痛风性关节炎动物模型,通过检测大鼠关节肿胀、HE染色、ELISA分析LXA4对急性痛风性关节炎动物模型的治疗效果;通过Western blot测定大鼠NLRP3炎症小体、Nrf2/Klf9/TXNRD2通路蛋白水平,对调控通路进行体内验证。结果:1.MSU诱导NLRP3炎症小体激活MSU刺激THP-1、BMDM细胞后,细胞培养液IL-1β浓度,cleaved-Caspase-1、matured-IL-1β水平明显升高;2.LXA4干预NLRP3炎症小体激活LXA4显著降低了MSU诱导的细胞培养液IL-1β浓度,cleaved-Caspase-1、matured-IL-1β水平,明显抑制细胞焦亡蛋白N端(GSDMD-N)的成熟与分泌,降低细胞死亡及LDH释放;LXA4不影响NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、pro-IL-1β表达,但是能够干预ASC斑点形成、ASC寡聚化,及ASC-NLRP3相互作用;3.LXA4干预NLRP3炎症小体上游信号:氧化应激LXA4抑制MSU诱导的ROS生成;LXA4降低NADPH氧化酶活性,抑制behavioural biomarkerp22phox表达、p47phox由胞质向胞膜的转移;LXA4抑制MSU诱导的线粒体ROS生成,减轻线粒体膜电位去极化、钙离子超载;4.LXA4通过抑制Nrf2来干预NLRP3炎症小体激活LXA4抑制MSU诱导的Nrf2高表达、核转位,及其下游抗氧化蛋白HO-1、SOD、GPX表达;Nrf2特异性激活剂-t BHQ,逆转了LXA4对NLRP3炎症小体的抑制作用;Nrf2的绑定蛋白Keap-1是LXA4的直接作用靶点;5.LXA4调控Nrf2/Klf9/TXNRD2通路LXA4下调Klf9、促进TXNRD2表达,t BHQ逆转LXA4对Klf9、TXNRD2的调控作用;LXA4减弱了Nrf2与Klf9启动子的相互作用,同时也降低了Klf9与TXNRD2启动子间的相互作用;6.LXA4依赖TXNRDGW-5720162发挥功能敲低TXNRD2后,LXA4对总ROS、线粒体ROS、NADPH氧化酶的干预作用被逆转;敲低TXNRD2减弱了LXA4对NLRP3炎症小体激活的抑制作用;7.在体内LXA4可以抑制MSU诱导的NLRP3炎症小体激活LXA4减弱了MSU诱导的痛风性关节炎关节肿胀、关节滑膜组织炎性细胞浸润、血清炎症因子水平,降低大鼠组织NLRP3、cleaved-Caspase-1、matured-IL-1β水平;LXA4对大鼠Nrf2/Klf9/TXNRD2调控作用与体外结果一致。结论:LXA4能够抑制MSU诱导的NLRP3炎症小体激活。其分子机制是LXA4通过干预Nrf2,上调TXNRD2表达,减弱氧化应激反应,最终阻断NLRP3炎症小体组装,来实现对NLRP3炎症小体激活的抑制。