目的:在本课题组前期研究中,通过对胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)患者的组织样本进行14-3-3ζ和OPN的蛋白及基因表达分析,发现14-3-3ζ和OPN可能共同促进CCA的侵袭和转移。本研究在前期工作的基础上,构建了不同14-3-3ζ表达的人CCA细胞株体外上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)模型,检测了14-3-3ζ+/-人 CCA 细胞 EMT前后 EMT 标志物(E-cadherin、N-cadherin、β-catenin 和 Vimentin)的变化,不同14-3-3ζ表达对CCA细胞迁移和侵袭能力的影响以及经14-3-3ζ介导的CCA细胞EMT后骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)特异性糖谱变化,进一步研究经14-3-3ζ介导的人CCA细胞EMT与OPN糖基化水平改变的关系。随后筛选出糖基转移酶GalNAc-T3并检测其在CCA中的表达,并分析GalNAc-T3的表达与临床病理及预后的关系,为阐明CCA早期迁移侵袭的机制提供科学依据。方法:(1)培养人CCA细胞株(HuCCT1和TFK-1),构建14-3-3ζ-siRNA质粒,转染人CCA细胞株,构建稳定表达的14-3-3ζ+/-的CCA细胞株,利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫印迹试验(Western-blot,WB)检测14-3-3 ζ 表达情况。(2)构建不同14-3-3ζ表达的人CCA细胞株体外EMT模型,相差显微镜观察细胞形态改变,qRT-PCR和WB检测14-3-3ζ+/-人CCA细胞EMT前后,EMT 标志物(E-cadherin、N-cadherin、β-catenin 和 Vimentin)变化。(3)Transwell侵袭实验和划痕实验检测不同14-3-3ζ表达的CCA细胞迁移和侵袭能Invasive bacterial infection力的差异。(4)提取总蛋白,经免疫沉淀技术纯化OPN,免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)检测 14-3-3ζ和 OPN 之间存在的关系,qRT-PCR和WB检测人CCA细胞EMT模型中14-3-3ζ和OPN的表达。(5)采用凝集素芯片技术,检测经14-3-3ζ介导的CCA细胞EMT转化后OPN特异性糖谱。(6)通过凝集素印迹和细胞凝集素组织化学方法验证凝集素芯片检测结果可靠性。(7)采用免疫组selleck HPLC织化学(Immunohistochemistry,IHC)、qRT-PCR 和 WB,检测CCA及其癌旁组织标本中糖基转移酶GalNAc-T3在基因和蛋白水平上的表达情况。(8)通过分析病人临床病理及预后资料,进一步研究GalNAc-T3与CCA临床病理类型及患者预后之间的关系。结果:(1)qRT-PCR和WB检测质粒转染人CCA细胞(TFK-1和HuCCT1)后14-3-3ζ的表达,发现CCA细胞中14-3-3ζ表达受到显著抑制。(2)相差显微镜观察14-3-3 ζ+/-人CCA细胞EMT体外模型细胞形态,发现细胞由柱状上皮细胞转化为纤维状间质细胞。抑制14-3-3 ζ的表达,CCA细胞EMT转化能力受到抑制。(3)14-3-3ζ+/-人CCA细胞EMT后,qRT-PCR和WB检测EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Vimentin),发现抑制 14-3-3ζ表达后,EMT标志物受到抑制。(4)Transwell侵袭实验和划痕实验检测14-3-3ζ+/-人CCA细胞EMT转化后CCA细胞迁徙移动能力改变,结果显示,抑制14-3-3ζ的表达,CCA细胞迁徙移动能力受到抑制。(5)CO-IP检测14-3-3ζ和OPN之间存在的关系,结果提示二者之间存在相互结合关系。(6)qRT-PCR和WB检测人CCA细胞EMT模型中14-3-3ζ和OPN的表达。结果表明,在EMT模型中,14-3-3ζ和OPN均高表达,协同促进EMT转化。(7)凝集素芯片检测CCA细胞经EMT转化后的OPN糖谱,发现OPN对凝集素LBA、Jacalin、Lotus、PHA-P、ACG和GAL1的亲和作用减弱,而对SNA-I、GAL1-S、BC2L-A、GAL2、PALa、Con A和PPL的亲和作用增强。OPN 糖谱中 GalNAc(α1,3)Galβ、Galβ3GalNAc、αFuc、GlcNAcβ4Manα3、α2,3 Sialic Acid 和 branched LacNAc 结构减少,而GalNANAα(2,6)Gal、branched LacNAc、High-mannose、GalNAcα1-3Gal、αMan和α/βGalNAc结构增多,提示CCA细胞EMT诱导OPN糖基化水平改变。(8)通过凝集素印迹方法验证凝集素芯片结果。结果显示,LBA凝集素结合的糖链结构在高表达14-3-3ζ的CCA细胞EAZD6738试剂MT转化后表达减少,凝集素印迹结果与芯片结果一致,证明芯片结果可靠。(9)通过荧光细胞凝集素免疫组织化学方法验证生物素标记的凝集素LBA的芯片结果。同样的凝集素LBA与高表达14-3-3ζ的CCA细胞EMT转化后细胞膜糖蛋白结合的荧光信号强度减弱,结果进一步验证了芯片结果可靠。(10)通过IHC、qRT-PCR和WB检测CCA病理组织及癌旁病理组织标本中糖基转移酶GalNAc-T3在基因和蛋白水平中的表达情况,发现GalNAc-T3在CCA中呈低表达。(11)通过分析病人临床病理及预后资料,发现GalNAc-T3在CCA病理组织中低表达,在癌旁组织标本中高表达,在Ⅰ-Ⅱ期CCA中低表达,在Ⅲ-Ⅳ期中低表达。在高分化癌中低表达,在中-低分化癌中低表达。GalNAc-T3高表达组CCA病人总体生存时间显著优于低表达组病人。结论:(1)成功构建14-3-3ζ+/-人CCA细胞EMT体外模型,发现在人CCA细胞EMT体外模型中,14-3-3ζ和OPN均高表达,协同促进EMT转化。(2)14-3-3ζ可通过介导CCA细胞EMT诱导OPN糖基化水平改变。该改变主要表现为特异性糖链GalNAcα(1,3)[αFuc(1,2)]Gal的表达减少,其催化的特异性糖基转移酶为GalNAc-T。(3)糖基转移酶GalNAc-T3在CCA的发生发展环节中发挥了重要作用,对于探寻CCA的早期诊断标志物及靶向治疗具有重要意义。(4)14-3-3 ζ介导胆管癌EMT转化后,可能通过关键分子GalNAc-T3调控OPN的O-糖基化。