三阴性乳腺癌(TNBC)具有高死亡率和预后性差等特点,是最具有侵袭性的癌症之一。肿瘤浸润性树突状细胞(TIDCs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤微环境中介导免疫反应。构建靶向核酸递送系统,双重调节TIDCs和TAMs或可增强肿瘤免疫和恢复免疫监测,用于三阴性乳腺癌治疗意义重大。实验目的:本研究中,设计开发了一种p H/ROS双响应型纳米颗粒(Mi R@PCPm P NPs),负载micro RNA 155(miR155),双重调节TIDCs和TAMs,激活肿瘤免疫和干预免疫抑制微环境。实验方法:研究内容主要包括载体构建、体内外实验评价,评估核酸递送系统安全性、抗肿瘤免疫应答和免疫抑制肿瘤微环境。载体构建用甘露糖连接PEG-CDM-PEI-ox-PCLDinaciclib生产商部分。空白纳米载体由酸不稳定的PEG-CDM-PEI和疏水性PCL通过活性氧(ROS)可裂解的过氧酸酯结合而成。该共聚物可以通过电子和疏水相互作用与miR155自组装形成复合物Mi R@PCPm P NPs。各合成部分用核磁氢谱确认化学结构,用动态光散射(DLS)方法测量不同p H与H_2O_2条件下纳米颗粒的粒径和电势,并用透射电子显微镜(TEM)观察复合物形态。琼脂糖凝胶电泳法评价不同N/P比例的复合物与miR155的结合作用。体外实验用从肿瘤组织中提取及分选的TIDCs与TAMs细胞进行研究。流式细胞术鉴定提取的TIDCs与TAMs细胞纯度,同时考察纳米复合物对TIDCs与TAMs细胞在不同p H值的细胞摄取,并用共聚焦显微镜(CLSM)观察摄取程度与溶酶体逃逸。MTT方法评价各制剂在不同p H值下对TAMs与TIDCs细胞的细胞毒性,采用流式细胞术和ELISA方法考察TIDCs与TAMs细胞的活性(CD80,CD 86,MHC II;IL-10,IL-12)。体内实验用小动物活体成像仪扫描纳米粒在各器官和肿瘤中分布情况,并用CLSM观察Cy5-miRNA在肿瘤组织中的分布。将Balb/c雌性小鼠设为PBS组、Mi R@PCPm P NPs组、Mi R@PCPP NPs组、游离miR155组、NC-Mi R@PCPm P NPs组,间隔一天给药,并定期称重和测量肿瘤体积。分别取每组中的前期治疗小鼠,处死后收集肿瘤组织与引流淋巴结并用流式细胞术评价免疫成分(TIDCs(CD11c、CD80、CD86),TAMs(F4/80、CD206、CD86),CD8+T细胞,Tregs,MDSCs),第十一天处死收集各组器官及肿瘤组织进行HE染色、免疫组化分析,并将各组肺部器官拍照。实验结果:核磁氢谱证明材料合成成功,p H=6.5下纳米粒的粒径为139.7 nm,同时纳米颗粒表面电荷从+23.5 m V增加到Common Variable Immune Deficiency+33.3 m V,表明在弱酸性条件下由于CDM断裂导致PEG脱离和PEI旋化。在H_2O_2条件下粒径增加到1394 nm,电位增加到+20.7 m V,由于H_2O_2的引入导致膨胀和不规则的外观,表明Mi R@PCPm P NPs在ROS条件下分解。TEM电镜下观察纳米粒分布均匀且呈规则球状,在弱酸条件下外观保持完整。当N/P比大于3时,miR155和PCPm P NPs之间完全络合,因此选择N/P=4进行之后的实验。体外提取的TIDCs与TAMs细胞的纯度在90%以上,细胞摄取显示与p H=6.5的非靶向纳米颗粒相比,Mi R@PCPm P NPs改善了TIDCs中Cy3-miRNA的转染,表明甘露糖-甘露糖受体Imidazole ketone erastin(MRs)相互作用介导的细胞摄取的改善,在TAMs中观察到类似的结果,且与CLSM结果一致。纳米复合物在实验浓度下表现出可忽略的毒性,表明具有良好的生物相容性和聚合物作为载体的安全性。在TIDCs中miR155纳米复合物上调了CD80、CD86和MHC II的表达,表明该递药系统可促进TIDCs成熟。在TAMs中miR155纳米复合物上调IL-12及下调IL-10的表达,表明该递药系统能使M2型转化M1型和抗原呈递能力的恢复。体内动物成像实验显示Mi R@PCPm P NPs在48 h显示出相比Mi R@PCPP NPs更强的荧光强度,说明表面电荷的改善可以促进纳米颗粒渗透到肿瘤组织中。小鼠实验中Mi R@PCPm P NPs组的肿瘤体积为137.6 mm~3,肿瘤重量为0.075 g,TGI为78.2%,说明甘露糖偶联物显示出最强的抗肿瘤作用。Mi R@PCPm P NPs组中显示出肺转移性结减少,表明靶向原发肿瘤中的TIDCs和TAMs可能增强抗肺转移的抗肿瘤免疫应答。流式细胞实验表明Mi R@PCPm P NPs组产生更高的CD8+T淋巴细胞浸润,MDSCs百分比降低,浸润性Tregs的比例降低,IL-10的下调,同时提高IL-12水平、IFN-γ上调和IL-10减少,表明miR155纳米复合物可以有效激活肿瘤微环境中的免疫细胞,双重调节TIDCs与TAMs。肿瘤引流淋巴结(TDLNs)内的免疫应答结果显示Mi R@PCPm P NPs组在TDLN中产生更高的CD11c+、CD80+、CD86+、IFN-γ、CD8+T细胞百分比,表明Mi R@PCPm P NPs激活的TIDCs可以迁移到TNLDs中以增强免疫应答。实验结论:肿瘤微环境的ROS刺激miR155释放导致TIDCs激活和TAMs再逆转,增强抗肿瘤免疫应答和双重调节免疫抑制肿瘤微环境。Mi R@PCPm P NPs在体内外均有明显免疫治疗效果,且无不良副作用。综上所述,miR155复合物对TIDCs和TAMs进行双重调节可能是TNBC免疫疗法的一种有前途的策略,值得在其他癌症中进一步探索。