肥胖的发病率逐年激增,已成为全球范围内一个严重的公共健康问题。肥胖与许多慢性疾病高度相关,如高血压、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病和慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD),CKD进展最终会发展为终末期肾脏疾病(End-stage renal disease,ESRD),严重影响患者的生活质量。肥胖是CKD发生和发展的独立危险因素,可直接导致肥胖相关肾小球疾病(Obesity related glomerulopathy,ORG)。然而ORG的发病机制很复杂,目前仍未被完全阐明,且缺乏特异而有效的治疗方法。因此,探索早期预防和治疗ORG的干预靶点是目前亟需解决的问题。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种由L细胞分泌的肠道肽类激素,可影响食欲、胰岛素合成并减轻体重。司美格鲁肽是一种新近研发的GLP-1类似物,由于其在人体内的半衰期延长至165小时,因此可每周应用一次。钠-葡萄糖共转运蛋白2(Sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制剂是目前较新的一种降糖药,可通过阻断肾小管的钠-葡萄糖的共转运,并以不依赖胰岛素的方式通过尿液排出多余的葡萄糖来维持血糖平衡。在恩格列净心血管结局事件的研究中,恩格列净还具有多效作用,可降低血压、减轻体重、降低肾小球高滤过及血清尿酸水平,从而导致心肾获益。目前尚无研究报道司美格鲁肽或恩格列净对肥胖相关肾损伤作用的具体机制。因此,明确药物干预靶点及作用机制,具有重要的理论意义和应用价值。代谢组学分析是一种系统生物学方法,可以揭示生物样品的整体代谢信息和代谢物水平变化。该方法已广泛应用于多种疾病的预测、诊断和疗效评价。相关研究表明,糖尿病患者血或尿的代谢物可以预测糖尿病肾病的进展。然而,目前为止,尚无研究报道肥胖对肾脏代谢的具体影响、其内在机制及干预措施。本课题分别从临床及动物层面进行研究,应用非靶向代谢组学方法,探讨肥胖对肾脏代谢的影响,揭示其机制并探寻防治措施,为肥胖相关肾脏损伤的治疗提供新思路及新靶点。第一部分肥胖对特发性膜性肾病患者肾脏病理的影响目的:探讨肥胖对特发性膜性肾病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)患者的临床及病理参数的影响。方法:应用回顾性研究方法,纳入2018年至2021年河北省人民医院经肾活检证实为IMN的230例患者。根据体重指数(Body mass index,BMI)将患者分为两组,分析各组临床和组织病理学数据。病理数据包括免疫荧光染色、肾小球硬化(Glomerulosclerosis,GS,0-2)、系膜细胞增殖(Mesangial cell proliferation,MCP,0-1)、肾小管萎缩(Tubular atrophy,TA,0-1)、间质纤维化(Interstitial fibrosis,IF,0-1)、血管壁厚度(Vascular wall thickness,VWT,0-1)以及综合评分(GMTIV,0-5)。结果:1.肥胖组的高血压和糖尿病发病率高于体重正常/超重组。2.肥胖组的收缩压、舒张压、血红蛋白、甘油三酯、血尿酸、24h尿蛋白浓度(Urine proteinuria concentration,UP)、MCP、IF和GMTIV评分均较对照组升高,而高密度脂蛋白胆固醇和免疫球蛋白A沉积评分较低。3.影响UP的危险因素包括淋巴细胞计更多数/白细胞计数、血清前白蛋白、免疫球蛋白G、镜下血尿、抗磷脂酶A2受体抗体、C3沉积。4.二元Logistic回归分析表明MCP与BMI呈正相关。5.有序Logistic回归分析表明,GMTIV与BMI和C3沉积呈正相关。小结:1.BMI与特发性膜性肾病的MCP及GMTIV评分呈正相关。2.肥胖是特发性膜性肾病患者系膜增生的危险因素。第二部分基于代谢组学研究司美格鲁肽对肥胖小鼠的肾脏保护作用目的:通过高脂饮食喂养建立肥胖小鼠模型,探讨肥胖小鼠肾脏代谢物的改变及司美格鲁肽的作用机制。方法:雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组(Normal fat diet,NFD)10只、高脂组(High fat diet,HFD)18只。对照组小鼠予以普通饲料喂养,高脂组小鼠均给予高脂饲料。喂养13周,从对照组、高脂组中各随机选择2只小鼠,进行肾脏病理检查,评估肥胖小鼠模型建立与否。高脂组小鼠随机分为高脂组(HFD)和司美格鲁肽干预组(HFDS)各8只。HFD组继续给予高脂饲料喂养,HFDS组小鼠在高脂饲料喂养基础上,腹腔内注射司美格鲁肽30nmol/Kg/d,每日1次,持续13周。每周记录小鼠体重。干预结束后进行葡萄糖耐量试验。取小鼠尿液测定尿白蛋白/肌酐比值(Urine albumin/creatinine ratio,UACR)。处死动物后,留取血清及肾脏。计算Lee’s指数和腹部脂肪指数,测定小鼠血液生化指标:尿酸(Uric acid,Ua)、空腹血糖(Fasting blood glucose,G0)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、血肌酐(Serum creatinine,Scr),进行肾脏组织病理分析,包括HE、PAS、Masson、油红O染色及电镜分析,留取部分肾脏组织进行代谢组学分析。结果:1.高脂饮食诱导肥胖小鼠模型的建立与正常对照组相比,HFD组小鼠体重在第2周开始明显增加,差异有统计学意义。造模结束后,HFD组小鼠体重明显高于对照组,肾脏病理可见HFD组肾小球体积增大、系膜基质增生、肾小管上皮细胞空泡化。HFD组小鼠Lee’s指数高于对照组,差异具有显著性。成功建立肥胖小鼠模型。2.司美格鲁肽干预后各组小鼠身体成分及生化参数的变化与高脂组相比,司美格鲁肽干预后,HFDS组小鼠体重明显下降。HFD组小鼠的Lee’s指数、腹部脂肪指数和右肾重量较正常对照组明显升高,给予司美格鲁肽干预后,上述指标均有所下降,其差异具有统计学意义。与正常对照组相比,HFD组小鼠出现代谢失衡,表现为Ua、G0、TC、TG、LDL、HDL、UACR水平明显升高。司美格鲁肽可显著降低以上参数水平。各组小鼠间血肌酐水平差异无统计学意义。与HFD组相比,司美格鲁肽显著降低空腹胰岛素、HOMA-IR,并下调葡萄糖曲线下面积,改善胰岛素抵抗。3.司美格鲁肽干预后各组小鼠肾脏病理的变化与正常对照组相比,光镜下可见HFD组的肾小球体积增大、系膜扩张、肾小管上皮细胞空泡化。Masson染色未见明显肾间质纤维化。司美格鲁肽可显著减轻肥胖小鼠的肾小球和肾小管损伤。油红O染色可见HFD小鼠肾脏中脂质沉积明显,司美格鲁肽可显著改善肾脏组织中脂质沉积。电镜显示,HFD组的足细胞肿胀、线粒体及内质网受损,司美格鲁肽干预后显著改善肾组织的超微结构损伤。4.司美格鲁肽干预后各组小鼠肾脏代谢的变化通过代谢组学成功筛选出377种差异代谢物(P<0.05),如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Niacinamide adenine dinucleotide,NAD)和腺苷等,在三组间差异具有统计学意义。嘌呤代谢、ABC转运蛋白、肾素分泌、Fox O信号通路、氨酰-t RNA生物合成和c GMP-PKG信号通路是肥胖小鼠中受到干扰的主要代谢通路。司美格鲁肽干预后涉及的相关富集途径包括磷脂和溶血磷脂代谢、嘌呤代谢、NAD代谢和胰岛素抵抗相关代谢。5.各组小鼠临床病理参数与肾脏代谢物的相关性分析结果表明,UACR与腺苷、乙酰甲胆碱、NAD、腺苷3’-磷酸、鸟苷呈负相关。与11,12-环氧二十碳三烯酸、Lyso PA(18:0/0:0)、不对称二甲基精氨酸吲哚丙烯酸、Lyso PE(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/0:0)、Lyso PE(0:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、花生四烯酸牛磺酸、亚油酰牛磺酸、PC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/0:0),PC(O-16:0/0:0)、PC(P-18:0/0:0)、PE(P-16:0e/0:0)、PE(O-16:0/0:0)、PE(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/0:0)、PE(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)、PG(18:2(9Z,12Z)/0:0)、PI(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0)、PS(16:0/0:0)、四氢-2-甲基-3-呋喃醇和全反式庚二磷酸酯呈正相关。小结:1.司美格鲁肽可改善肥胖小鼠的脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗及肾脏病理损伤。2.司美格鲁肽可改善肥胖小鼠的肾脏组织代谢,上调NAD~+和腺苷水平,相关富集途径包括磷脂和溶血磷脂代谢、嘌呤代谢、NAD代谢和胰岛素抵抗相关代谢。第三部分基于代谢组学研究恩格列净对肥胖小鼠的肾脏保护作用目的:通过高脂喂养建立肥胖小鼠模型,探讨肥胖小鼠肾脏代谢物的改变及恩格列净的作用机制。方法:雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组(Normal control diet,NCD)10只、高脂组18只。喂养13周,从对照组、高脂组中各随机选择2只小鼠,进行肾脏病理检查,评估肥胖小鼠模型建立与否。高脂组小鼠随机分为高脂组(HFD)和恩格列净干预组(EMPA)各8只。HFD组继续给予高脂饲料喂养,EMPA组小鼠在高脂饲料喂养基础上,给予恩格列净10mg/kg/d灌胃,持续13周。每周记录小鼠体重。干预结束后进行葡萄糖耐量试验。取小鼠尿液测定UACR。处死动物后,留取血清及肾脏。计算Lee’s指数和腹部脂肪指数,测定小鼠血液生化指标:Ua、G0、TC、TG、LDL、HDL、Scr,进行肾脏组织病理分析,包括HE、PAS、Masson、油红O染色及电镜分析,留取部分肾脏组织进行代谢组学分析。结果:1.肥胖模型评估HFD组小鼠的体重、Lee’s指数和肾小球直径显著高于空白对照组。在光镜下,HFD组小鼠的肾小球体积增加,系膜基质增多。均提示肥胖模型建立成功。2.恩格列净改善肥胖小鼠的糖脂代谢失衡HFD组小鼠的Ua、TG、TC、LDL、HDL和UACR水平均高于NCD组,说明肥胖小鼠出现明显的代谢紊乱。各组间的Scr水平无统计学差异。与空白对照组相比,HFD组小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数均明显升高,提示存在胰岛素抵抗。恩格列净干预后可改善HFD诱导的胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱。3.恩格列净改善肥胖小鼠的肾脏病理损伤肥胖小鼠的Lee’s指数、腹部脂肪指数和右肾重量较对照组显著增加,恩格列净干预后上述参数水平均下降,差异具有统计学意义。在光镜下,HFD组小鼠的肾小球体积增加、系膜扩张、肾小管上皮细胞空泡化,肾间质纤维化不明显。油红O染色提示HFD组小鼠的肾组织中脂质沉积显著。恩格列净可显著减轻高脂饮食诱导的肾小球和肾小管损伤。电镜显示HFD组小鼠的足突、内质网和线粒体均出现受损,恩格列净改善了肥胖小鼠肾脏的超微结构损伤。4.恩格列净对肥胖小鼠肾脏代谢的影响通过代谢组学筛选出46种同时在三组小鼠中表达的肾脏代谢物。与正常对照组相比,肥胖小鼠表现出较高水平的全反式庚烯基二磷酸、胆绿素、半乳二糖、半乳生物酰神经酰胺(d18:1/16:0)、肌苷、甲基异柠檬酸、尿酸、黄原菌素、O-戊二酰肉碱、PG(20:3(8Z,1Z,14Z)/0:0)、PG(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/00:0)、PE(O-16:0/0:0)、PG(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0-0)以及较低水平的腺苷。恩格列净则以相反的方向调控这些代谢产物。进一步使用KEGG数据库分析相关代谢途径,涉及嘌呤代谢、磷脂代谢和胆绿素代谢。5.各组小鼠临床病理参数与肾脏代谢物的相关性分析UACR与腺苷呈负相关,与胆绿素、半乳糖、尿酸、黄原菌素、PE(O-16:0/0:0)、PG(20:3(8Z,1Z,14Z)/0:0)、PG(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/00:0)等呈正相关。这些代谢产物可以作为潜在的生物标志物。小结:1.恩格列净可改善肥胖小鼠的脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗及肾脏病理损伤。2.恩格列净可改善肥胖小鼠的肾脏组织代谢,上调腺苷并降低尿酸水平,相关富集途径包括磷脂代谢、嘌呤代谢和胆绿素代谢。第四部分司美格鲁肽及恩格列净改善肥胖小鼠肾脏损伤的分子机制目的:观察司美格鲁肽及恩格列净对肥胖相关肾脏损伤的保护作用,探讨具体分子机制。方法:在先前动物实验部分,研究结果表明组间差异代谢物主要是腺苷、NAD、尿酸等。这些代谢物大多与炎症反应和氧化应激有关。故根据上部分实验中差异代谢物的生理效应及上游信获悉更多号通路,用ELISA试剂盒测定血液中炎症因子及氧化应激参数,包括:肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)。提取肾脏组织的RNA,反转录,PCR扩增,提取肾组织总蛋白,测定蛋白浓度,分别通过RT-PCR、Western blot测定炎症信号通路相关蛋白IL-1β、TNF-α、核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)及氧化应激信号通路相关蛋白核转录因子相关因子-2(Nuclear transcription factor-related factor-2,Nrf2)、血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)在转录及蛋白翻译水平表达的变化。结果:1.各组小鼠血液炎症及氧化应激因子水平的比较HFD组的小鼠表现出SOD活性降低及MDA水平升高,说明肥胖小鼠出现过度的氧化应激。司美格鲁肽、恩格列净均能显著增强SOD活性并降低肾脏MDA水平,维持氧化-抗氧化平衡。HFD组小鼠的TNF-α、IL6和IL-1β显著升高。司美格鲁肽、恩格列净干预后,TNF-α、IL6和IL-1β的表达水平均显著降低。2.各组小鼠炎症及氧化应激信号通路相关基因m RNA水平的比较RT-PCR检测结果显示,与正常对照组相比,HFD组小鼠肾脏的IL-1β、TNF-α及NF-κB m RNA表达水平明显升高,而经司美格鲁肽、恩格列净干预后,上述m RNA水平较HFD组均有所下降,差异具有统计学意义。与正常对照组相比,HFD组小鼠肾脏的Nrf2、HO-1m RNA表达水平明显下降,而经司美格鲁肽、恩格列净干预后,上述m RNA水平较HFD组均有所上升,差异具有统计学意义。3.各组小鼠炎症及氧化应激信号通路相关蛋白水平表达的比较Western Blot检测结果显示,与正常对照组相比,HFD组小鼠肾脏的IL-1β、TNF-α及NF-κB的蛋白表达水平明显升高,而经司美格鲁肽、恩格列净干预后,上述蛋白表达水平较HFD组均有所下降,差异具有统计学意义。与正常对照组相比,HFD组小鼠肾脏的Nrf2、HO-1蛋白翻译表达水平明显降低,而经司美格鲁肽、恩格列净干预后,上述蛋白表达水平较HFD组均上升,差异具有统计学意义。小结:1.司美格鲁肽、恩格列净均可通过抑制NF-κB/IL-1β/TNF-α改善高脂诱导的肥胖小鼠的炎症反应。2.司美格鲁肽、恩格列净均可通过调控Nrf2/HO-1信号通路改善高脂诱导的肥胖小鼠的氧化应激。结论:1.肥胖是特发性膜性肾病患者系膜增生的危险因素。2.司美格鲁肽可改善肥胖小鼠的肾脏组织代谢,上调NAHeart-specific molecular biomarkersD~+和腺苷水平,相关富集途径包括磷脂和溶血磷脂代谢、嘌呤代谢、NAD代谢和胰岛素抵抗相关代谢。3.恩格列净可改善肥胖小鼠的肾脏组织代谢,上调腺苷并降低尿酸水平,相关富集途径包括磷脂代谢、嘌呤代谢和胆绿素代谢。4.司美格鲁肽、恩格列净均可通过抑制NF-κB、IL-1β、TNF-α并调控Nrf2/HO-1信号通路改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的炎症反应、氧化应激。