喜树(Camptotheca acuminata Decne)是蓝果树科、喜树属植物,是中国特有的多年生高大落叶hepatic cirrhosis乔木。喜树碱(Camptothecin,CPT)和10-羟基喜树碱(10-Hydroxycamp tothecin,10-HCPT/HCPT)是喜树中所含有的吲哚类生物碱。作为具有高效抗癌作用的天然成分,CPT和HCPT具有广谱的抗癌效果,在临床上用于治疗原发性肝癌、胃癌、肺癌、直肠癌、膀胱癌等。CPT和HCPT难溶于水,生物利用度低,导致药物分子在体内循环过程中不稳定,提取过程耗时费力,操作技术冗长,需要大量溶剂,最终目标分子在连续高温下热分解,对CPT和HCPT的大规模生产带来了很大的困难。本研究选取易于储藏的喜树种子作为提取原材料,建立一种现代提取技术与绿色溶剂相结合、操作简单、效率高、能耗低的绿色高效提取方法。在此基础上,制备了具有“归巢效应”的仿生给药体系,并评价其体内外抗癌活性,具体研究结果如下:(1)采用超高压(UHP)结合十二烷基磺酸钠(SLS)水溶液胶束介质同时提取喜树种子中CPT和HCPT两种难溶生物碱。通过单因素与响应面结合法获得CPT与HCPT的最佳提取工艺:SLS的浓度是60 mg/m L,料液比为1:25,保压时间为3.9 min,提取压力为110 MPa,CPT和HCPT的提取率分别为82.68±1.2%和89.02±1.2%。经脱色,固液萃取,柱层析,反溶剂重结晶纯化后CPT和HCPT的纯度分别为94.51±0.22%和96.76±0.29%。研究表明此提取方法稳定性好,重复性高。(2)超高压提取(UHPE)与索氏提取、乙醇匀浆提取、微波提取和超声提取等传统提取方法在提取两种难溶生物碱时的能耗、提取率及提取机制研究。结果显示:UHPE具有提取效率高能耗低的特点。UHPE的提取率与索氏提取、乙醇匀浆提取、微波提取以及超声提取法的提取率相当,但能耗最低,单位能耗仅为4.68×10~3 J/mg(以提取CPT和HCPT总量为计算基准),并显著缩短了提取时间。索氏提取和乙醇匀浆提取的单位能耗分别为3.29×10~6 J/mg和3.24×10~6 J/mg,微波提取和超声提取的单位能耗分别为1.09×10~6 J/mg和1.07×10~6 J/mg。对密度泛函理论(DFT)和传质动力学的研究验证了超高压结合胶束介质提取的机理,SLS与CPT和HCPT通过分子间氢键和静电作用力结合成超分子折叠成胶束从而将喜树种子中CPT和HCPT高效的提取Bucladesine小鼠出来,作用力的结合增加了目标成分在混合体系中的溶解度。从植物组织中提取目标活性成分由快速洗涤和缓慢扩散两个同时进行的过程组成,高压高效破碎喜树种子细胞的亚结构,活性成分从胚乳中快速释放。(3)将羟基喜树碱(HCPT)与白芨多糖(BSP)通过丁二酸酐化学偶联,制备得到的前药胶束外部包被肿瘤细胞膜脂质体杂化仿生外壳,最终得到仿生给药体系(T-Lipo-HCPT-BSP)。通过红外光谱(FTIR),核磁共振氢谱(~1HNMR),X射线衍射(XRD),差示扫描量热(DSC)和热重(TG)以及紫外分光光度计(UV)等表征,证明HCPT和BSP成功合成。对不同配比的HCPT和BSP进行反应,得到的样品测其临界胶束浓度分别为0.004(6:1)、0.008(5:1)、0.063(4:1)、0.080(3:1)、0.360(2:1)、0.507(1:1)、0.725(0.5:1)和1.212 mg/m L(0.1:1),根据载药量和得率的优化,最终选择HCPT:BSP=3:1为最佳的合成比例。通过动态光散射(DLS)、Zeta电位和扫描电子显微镜(SEM)的表征,证实所制备的前药胶束纳米粒子的粒径均一,形貌良好,平均粒径为210±2.3 nm。同时在前药胶束外部包被肿瘤细胞膜脂质体杂化仿生外壳,选择载药量高,得率高,CMC为0.080 mg/m L(3:1)的前药胶束进行肿瘤细胞膜脂质体杂化膜的包被,通过透射电子显微镜(TEM)和凝胶电泳(SDS-PAGE)的表征证明仿生外壳的成功包被。(4)T-Lipo-HCPT-BSP在生理环境下的PBS缓冲液中的稳定性及溶血性实验,表明了T-Lipo-HCPT-BSP的静脉注射安全性。体外释放及细胞摄取实验进一步证明了T-Lipo-HCPT-BSP可以在肿瘤环境条件下释放和积累,并通过不同方式进入细胞发挥抑制肿瘤细胞血管生成作用从而抑制肿瘤生长。在生理环境下的PBS缓冲溶液中,纳米粒子未出现明显的团聚现象,粒子的大小趋于稳定,并未出现溶血现象,由此证明T-Lipo-HCPT-BSP可实现静脉注射的方式给药。HCPT-BSP和T-Lipo-HCPT-BSP可以通过网格蛋白、小窝蛋白和能量消耗介导的细胞内吞途径被摄取,从而进入肠道上皮细胞,T-Lipo-HCPT-BSP由于粒径的增大部分粒子也可通过巨胞饮的方式进入细胞。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验发现BSP、HCPT、HCPT-BSP和T-Lipo-HCPT-BSP均具有抑制血管生成的作用,并且协同给药的效果大于单独给药,T-Lipo-HCPT-BSP组血管普遍变细,血管形态异常,未生成完整的血管脉络,证明了HCPT与BSP协同作用在高效抑制肿瘤生长的上的潜能。T-Lipo-HCPT-BSP在不同的p H缓冲液中释放的药物含量不同,在模拟肿瘤部位的酸性环境中药物的累积释放量最高120 h达到84.67%,T-Lipo-HCPT-BSP的药物累计释放量比HCPT-BSP组更高,这也在Caco-2细胞内化实验证明中得到印证,在HCPT-BSP和T-Lipo-HCPT-BSP中检测到平均荧光强度在1 h和4 h时都远高于游离的HCPT,其中包被仿生细胞膜的前药T-Lipo-HCPT-BSP更易于被细胞摄取,并呈现高度的时间依赖性。这主要是由于T-Lipo-HCPT-BSP表现出良好的表观渗透系数。与游离的HCPT相比,HCPT-BSP和T-Lipo-HCPT-BSP的表观渗透系数分别为原药的4.15倍和8.61倍。(5)考察HCPT-BSP以及T-Lipo-HCPT-BSP在体内外的抗肿瘤效果。通过体外的细胞以及体内小鼠活体实验分别验证了T-Lipo-HCPT-BSP发挥细胞毒性,促进细胞凋亡,抑制细胞周期,阻止细胞迁移以及靶向肿瘤部位抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的能力。HCPT-BSP和T-Lipo-HCPT-BSP组在体外对LLC细胞和Caco-2细胞均呈现出高于原药HCPT组的细胞毒性,并且由于包被的LLC细胞的同源细胞膜,T-Lipo-HCPT-BSP对LLC的细胞毒性远大于对Caco-2细胞的细胞毒性。细胞毒性作用的增强也进一步说明LLC细胞对T-Lipo-HCPT-BSP有较好的摄取作用,使药物在细胞中达到有效的积累。此外HCPT作为一种周期特异性药物,细胞周期实验看出高剂量T-Lipo-HCPT-BSP治疗组可以使LLC细胞阻滞在S期43.01±2.1%,阻滞在G_2/M3-Methyladenine纯度期10.27±2.6%,从而诱导其凋亡。T-Lipo-HCPT-BSP对LLC细胞的迁移能力有明显的抑制作用,与空白对照组相比(以100%的细胞迁移率计算),100μg/m L的T-Lipo-HCPT-BSP细胞迁移率仅为9.26%。另外,在流式细胞仪对细胞凋亡的考察中进一步证明了T-Lipo-HCPT-BSP诱导细胞凋亡的能力,在细胞与药物共同孵育36 h后,与HCPT原药的晚期凋亡率相比(45.03%),T-Lipo-HCPT-BSP给药组的细胞晚期凋亡率高达95.68%。以上细胞实验结果也在荷瘤小鼠的近红外荧光分布以及荷瘤小鼠的治疗实验中得到体现,证明了T-Lipo-BSP-HCPT能更好的靶向肿瘤部位,克服化疗中肿瘤药物的多药耐药(MDR)性,然后在肿瘤部位分布和积累。通过21天的治疗,与空白生理盐水组相比,T-Lipo-HCPT-BSP/H组荷瘤小鼠的肿瘤抑制率高达89.9%,并且治疗效果优于HCPT原药组和HCPT-BSP组。H&E切片染色实验结果可以看出高剂量组在达到较高抗癌活性的同时,对荷瘤小鼠的内脏组织没有明显的毒性,具有安全性,低毒性的特点。综合以上实验结果,可发挥协同给药作用的T-Lipo-HCPT-BSP作为一种具有“归巢效应”的仿生给药体系,具有很高的应用前景和临床价值。