由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]引起的油菜菌核病(Rape sclerotinia stem rot)是世界范围内油菜生产中的重要病害。核盘菌的致病机理比较复杂,主要致病因子包括水解酶类、草酸毒素及分泌蛋白等。细胞壁是植物病原真菌重要的细胞结构,其主要由几丁质和β-葡聚糖组成,在维持细胞正常的形态、抵御各种胁迫,及识别并侵染寄主等过程中发挥着重要作用。除大分子糖类外,许多蛋白被糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)修饰而锚定于细胞壁上并发挥着重要作用,到目前为止,对于核盘菌细胞壁GPI锚定蛋白(GPI-anchored cell wall proteins,GPI-CWPs)的功能尚不清楚确认细节。本研究发现核盘菌SsGsr1蛋白N端具有一个典型的信号肽结构,且C端具有GPI锚定信Acute neuropathologies号,中间区域富含甘氨酸和丝氨酸,推测其为一个细胞壁GPI锚定蛋白,系统发育分析表明SsGsr1的同源蛋白主要分布在子囊菌中,且集中分布于核盘菌属、葡萄核盘菌属和链核盘菌属等。通过实时荧光定量PCR分析其编码基因在核盘菌侵染烟草过程中的表达模式,发现其在侵染初期的表达量最高;进一步依据同源重组的原理对该基因进行了敲除。敲除转化子的菌丝形态以及菌株生长速率与野生型菌株相比无显著差异,但对本氏烟和油菜的致病力均显著低于野生型菌株,表明SsGsr1参与核盘菌的致病过程。本研究通过原生质体转化技术获得了表达HA-SsGsr1融合蛋白的菌株,将其细胞质蛋白与细胞壁蛋白分别提取,利用免疫印迹证实SsGsr1定位在核盘菌菌丝的细胞壁上;进一步通过透射电子显微镜观察及刚果红染色观察SsGSR1基因敲除转化子菌丝,发现其细胞壁外层物质分布异常,且敲除转化子对细胞壁抑制剂更敏感,表明SsGsr1在维持核盘菌菌丝细胞壁完整性方面至关重要。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达技术对SsGsr1在本氏烟中进行了表达,发现其可诱导本氏烟叶片坏死,而缺失信号肽则不能诱导本氏烟叶片坏死,表明SsGsr1靶向质外体诱导植物细胞死亡。除本氏烟外,SsGsr1还可以诱导辣椒和番茄的叶片坏死,表明该蛋白诱导细胞死亡的能力具有一定的广谱性。纯化的SsGsr1蛋白可以引起本氏烟胼胝质的积累、活性氧的迸发以及防御基因的上调表达,表明SsGsr1能够引发植物的PTI反应。SsGsr1中存在一个由10个高度相似的重复单www.selleck.cn/products/lxh254元组成的串联重复序列,通过截短突变分析表明其中第3-9个重复单元负责诱导植物细胞坏死。同源序列多重比对分析发现串联重复的拷贝数在SsGsr1同源蛋白中存在差异,其中灰葡萄孢Bc Gsr1和链核盘菌Mf Gsr1分别缺失了2个和4个重复单元,且均丧失了诱导坏死的能力。本研究还发现该串联重复序列在重庆田间油菜菌核病菌群体中存在多样性,部分菌株中的SsGsr1蛋白缺失了一个关键性的重复序列并丧失了诱导坏死的活性。综上所述,本研究证实核盘菌细胞壁GPI锚定蛋白SsGsr1不仅是维持核盘菌细胞壁结构、完整性及致病力所必需的,还可以通过其中的串联重复序列诱导寄主植物细胞坏死。研究结果为进一步深入揭示核盘菌的致病机制提供了重要线索,也为深入理解GPI锚定蛋白及串联重复序列在植物病原真菌中的作用奠定了基础。