目的:观察通络益肾方对肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMCs)源外泌体microRNA(miRNA)表达的影响,探索Nucleic Acid Electrophoresis该方通过调控GMCs源外泌体miRNA的表达而抑制足细胞焦亡的机制。方法:实验一高糖培养的GMCs源外泌体差异miRNA表达谱分析、靶标预测及功能富集1.大鼠GMCs随机分为两组,即正常组(NG,5.6 mmol/L葡萄糖)和高糖组(HG,30确认细节 mmol/L葡萄糖),培养24 h后,收集两组细胞上清液,超速离心法提取外泌体。通过高通量测序技术进行差异miRNA表达谱筛查和分析筛选。2.使用miRanda和RNAhybrid数据库对差异miRNA的靶基因进行预测,进行Gene Ontology(GO)及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,探索差异miRNA主要的生物学功能和信号通路。3.测序获得的差异miRNA进行RT-PCR验证,最终得到具有统计学差异的miRNA。4.两组外泌体进行PKH67染色标记,并与足细胞共培养24 h,观察足细胞对外泌体的吞噬情况。实验二GMCs源外泌体对足细胞焦亡的影响及通络益肾方的干预研究1.大鼠GMCs随机分为:正常组:5.6 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清;高糖组:30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清;外泌体抑制剂组:30 mmol/L葡萄糖+外泌体抑制剂(GW4869 10μM)+10%正常大鼠血清;通络益肾方组:30 mmol/L葡萄糖+10%通络益肾方含药血清;miR-363-3p inhibitor组:30 mmol/L葡萄糖+miR-363-3p inhibitor+10%正常大鼠血清;miR-200c-3p inhibitor组:30 mmol/L葡萄糖+miR-200c-3p inhibitor+10%正常大鼠血清,培养24 h后,收集细胞上清液,超速离心法提取各组外泌体。2.每组外泌体按照50μg/ml浓度与足细胞共培养,将足细胞分为外泌体空白组(NO-EXO组):不加外泌体的足细胞;外泌体正常糖组(NG-GMCs-EXO组):5.6 mmol/L葡萄糖处理的GMCs源外泌体孵育的足细胞;外泌体高糖组(HG-GMCs-EXO组):高糖处理的GMCs源外泌体孵育的足细胞;外泌体抑制剂组(GW4869+HG-GMCs-EXO组):GW4869处理的高糖GMCs源外泌体孵育的足细胞;外泌体通络益肾方组(TLYSF+HG-GMCs-EXO组):通络益肾方处理的高糖GMCs源外泌体孵育的足细胞;外泌体miR-363-3p inhibitor组(miR-363-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组):miR-363-3p-inhibitor处理的高糖GMCs源外泌体孵育的足细胞;外泌体miR-200c-3p inhibitor组(miR-200c-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组):miR-200c-3p-inhibitor处理的高糖GMCs源外泌体孵育的足细胞,培养24 h后收集。3.Hoechst33342/PI荧光染色法观察足细胞膜完整性。4.透射电镜观察足细胞超微结构及焦亡情况。5.RT-PCR检测大鼠足细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1βmRNA的表达水平。6.Western Blot检测大鼠足细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白的表达水平。结果:实验一1.测序共获得10条差异miRNA分子,均为上调。2.运用生物学信息分析,对差异miRNA靶基因进行GO和KEGG富集分析,GO结果提示,可能富集在代谢、突触传递、细胞分化等过程对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发病机制进行调控;KEGG通路分析结果显示,DN发病机制主要与组氨酸代谢、突触囊泡周期、细胞凋亡、II型糖尿病、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、Toll样受体信号通路等相关。3.足细胞与PKH67标记的外泌体共培养结果显示,足细胞可成功摄取外泌体。实验二1.Hoechst33342/PI荧光染色结果显示,与NO-EXO组比,HG-GMCs-EXO组PI阳性细胞明显增多(P<0.01),提示焦亡细胞比例升高。与HG-GMCs-EXO组比,TLYSF+HG-GMCs-EXO组、NG-GMCs-EXO组、GW4869+HG-GMCs-EXO组、miR-363-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组、miR-200c-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组焦亡比例显著下调(P<0.01)。2.透射电镜结果显示,NO-EXO组细胞形态、结构完整,细胞膜光滑完整,细胞器结构基本正常,线粒体形态、结构正常,无空洞改变;HG-GMCs-EXO组表现为细胞膨大变形,细胞膜表面微绒毛脱落、膜完整性被破坏,伴有细胞内容物的流出,粗面内质网扩张,线粒体空洞形成,为焦亡的典型形态学特征。与HG-GMCs-EXO组相比,TLYSF+HG-GMCs寻找更多-EXO组细胞结构正常,未发生肿胀、变形,细胞膜基本完整,线粒体损伤程度较轻;NG-GMCs-EXO组、GW4869+HG-GMCs-EXO组、miR-363-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组、miR-200c-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组足细胞损伤情况明显减轻。3.RT-PCR检测大鼠足细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1βmRNA的表达结果表示,与NO-EXO组相比,HG-GMCs-EXO组NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1βmRNA表达明显上调(P<0.01)。与HG-GMCs-EXO组相比,TLYSF+HGGMCs-EXO组NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1βmRNA表达下调(P<0.01);NG-GMCs-EXO组、GW4869+HG-GMCs-EXO组、miR-363-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组和miR-200c-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1βmRNA表达均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01)。4.Western Blot检测大鼠足细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白的表达结果显示,与NO-EXO组相比,HG-GMCs-EXO组NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达水平均显著上调(P<0.01)。与HG-GMCs-EXO组比较,TLYSF+HG-GMCs-EXO组NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达水平明显下调(P<0.01);NG-GMCs-EXO组、GW4869+HG-GMCs-EXO组、miR-363-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组和miR-200c-3p-inhibitor+HG-GMCs-EXO组的NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达水平均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01)。结论:1.高糖环境下GMCs和足细胞存在串话,促进DN进展,其作用机制可能是通过外泌体miR-363-3p和miR-200c-3p表达上调,促进足细胞焦亡。2.通络益肾方通过下调NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1βmRNA和蛋白表达水平,改善足细胞焦亡情况,改善DN肾脏损伤,保护肾功能。