研究背景和目的:牙周炎是一种由细菌感染引起的疾病,微生物与宿主之间的作用在疾病过程中起到了关键的作用。寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)YW002在宿主免疫调节和抑制炎症方面有着广泛的应用。在前期研究中,我们发现ODN YW002可诱导人牙周膜干细胞中早期成骨标志性因子碱性磷酸酶活性升高,下调炎症晚期RAW 264.7细胞一氧化氮的合成,为ODN YW002后续应用于牙周炎的研究奠定实验基础。然而,游离的ODN不易黏附细胞、极易被核酸酶酶INCB018424 IC50解,使ODN的临床应用受到了限制。通过特定的化学修饰可增强ODN的稳定性,但有文献表明,由于其序列选择性和专一性差,化学修饰存在副作用。因此,使用纳米粒子系统是目前递送ODN常用的解决策略。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)是目前最常使用的基因载体,但是它存在着生物毒性。研究表明,对PEI进行修饰可以降低其细胞毒性。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是细胞外基质常见成分,具有良好的生物相容性。相较于PEI,CS修饰的PEI衍生物(PEI-CS)具有低细胞毒性,可实现核酸的高效递送,是一种良好的基因载体。本研究中,我们拟制备PEI衍生物PEI-CS,构建P此网站EI-CS/YW002纳米粒子用于YW002的递送,探究PEI-CS/YW002纳米粒子在牙周炎治疗中的新应用。研究方法:1、PEI-CS的合成和表征:采用Michael加成反应制备PEI-CS,利用~1H-核磁共振(~1H-nuclear magnetic resonance,~1H-NMR)对其进行表征,运用凝胶电泳实验、粒径和电位检测对PEI-CS/YW002纳米粒子进行评价。2、PEI-CS的转染效率和细胞毒性:使用共聚焦激光显微镜(confocal laser scanning microscopmedical competenciesy,CLSM)检测ODN YW002的细胞内吞和转染效率;使用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7作为实验细胞,CCK-8法检测了PEI-CS/YW002纳米粒子对细胞的毒性。3、PEI-CS/YW002纳米粒子在牙周炎中的应用:本研究使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建体外RAW 264.7细胞炎症模型,通过定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测PEI-CS/YW002纳米粒子对牙周炎症介质白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因和蛋白表达的影响,并与游离的YW002和硫代修饰的YW002-s进行比较。研究结果:1、~1H-NMR结果显示,本实验制备的PEI-CS具有与PEI和CS相似的特征峰,这证明成功合成了PEI-CS;凝胶电泳实验结果表明,当PEI-CS与YW002的质量比为≥4:1时,PEI-CS可以有效阻碍YW002迁移,这表明PEI-CS与YW002之间结合形成了纳米粒子;粒径与电位检测结果显示,当质量比为4:1时,测得PEI-CS/YW002纳米粒子粒径是240.03±0.38 nm,Zeta电位是+9.10±1.78 m V。以上实验表明PEI-CS/YW002纳米粒子最适转染效率对应的质量比例,即4:1。2、CLSM结果显示,YW002与RAW 264.7细胞共同孵育后,可发现带Cy-5荧光标记的YW002在一定时间内通过胞吞作用进入细胞内。CCK-8法结果表明,当PEI-CS与YW002的质量比为≤8:1时,PEI-CS/YW002纳米粒子作用下RAW264.7细胞的细胞存活率与对照组无显著性差异,表明在一定质量比使用范围内,PEI-CS具有良好的生物相容性。3、qRT-PCR和Western blot结果表明,RAW 264.7细胞在LPS刺激下,炎症模型成功构建,PEI-CS/YW002纳米粒子组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达与LPS刺激组相比显著下降,证明了PEI-CS/YW002纳米粒子对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症模型有良好的抗炎作用,且抗炎效果优于化学修饰的YW002-s。研究结论:PEI-CS具有良好的生物相容性,在体外未见明显毒性,可实现ODN YW002细胞内高效递送,具有良好的抗炎作用,在未来有可能成为治疗牙周炎的一种新手段。