急性肾损伤(AKI)通常表现为数小时至数天内血清肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)突然升高、尿量减少和肾小球滤过率(GFR)下降,AKI通常伴有多种并发症,如高钾血症、代谢性酸中毒、容量超负荷和GFR降低导致的尿毒症症状。AKI是一种复杂疾病,手术、脓毒症、创伤和对药物的毒性反应都可能诱发AKI。在AKI的发生发展过程中,活性氧(ROS)在肾功能的稳态中起着至关重要的作用。当ROS生成和消除之间的平衡被打破时,肾脏浸润和内源性细胞产生的过量ROS会通过线粒体肿胀和功能障碍诱导细胞凋亡。不幸的是,目前只有温和的治疗方法,如补液、肾透析和其他一些支持性治疗。因此,开发有效的治疗AKI的药物迫在眉睫。鉴于ROS在AKI的发生和发展中的重要作用,消除ROS似乎是预防和治疗AKI的一种有希望的策略。随着纳米技术的出现并迅速发展,具有抗炎抗氧化治疗效果的纳米药物成为包括AKI在内的各种ROS相关疾病的有效治疗药物,预计将对人类健康产生深远影响。其中,纳米酶因其既有天然酶的高催化活性,又有模拟酶稳定而经济的特点,在众多药物中脱颖而出。纳米酶克服了天然酶只能在温和条件下才能发挥催化作用的局限性,并且具有模拟过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等天然酶活性,对ROS表现出广谱的清除能力。硫化氢(H2S)是一种无处不在的气态信号分子,是三种内源性气体递质之一,在许多生理过程中起着重要作用,如神经调控、血管张力调节、细胞保护、氧感应、炎症调节和细胞生长。多硫化氢(H2Sn)已被发现可以由3-巯基丙酮酸硫转移酶(3MST)产生,并能够调节离子通道、肿瘤抑制因子和蛋白激酶的活性。蛋白质的半胱氨酸残基过硫化被认为是H2S作用的一种方式,H2S将硫原子添加到目标蛋白的半胱氨酸残基上,从而发挥作用。由于H2S与半胱氨酸残基中硫的氧化态相同,H2S不易对半胱氨酸残基硫化。相反,氧化态为0或-1的H2Sn很容易硫化半胱氨酸残基的硫醇。肿瘤抑制蛋白磷酸和紧张素同源物(PTEN)、蛋白激酶G1α和糖酵解酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等蛋白都是H2Sn的靶蛋白。中药是以中国传统医药理论指导采集、炮制、制剂,说明作用机理,指导临床应用的药物。中药主要来源于天然药及其加工品,包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物。除了纳米药物具有清除ROS抗氧化的能力以外,中药多酚也可以与ROS相互作用,从而在细胞活力受到严重影响之前终止链式反应。中药多酚是存在于植物中的天然化合物,具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物活性。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)是绿茶的主要多酚成分,是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂,可用于治疗多种疾病。EGCG已被证明具有抗炎、抗关节炎、抗菌、抗血管生成、抗衰老、抗病毒和神经保护作用,这些作用可能在治疗许多疾病中具有治疗应用,包括动脉粥样硬化和心血管和代谢疾病。EGCG可以通过清除自由基来达到抗氧化的目的,与铁螯合是清除自由基的一种重要方式。此外,EGCG在体内外都能增加与氧化应激相关的抗氧化酶的水平,包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)和血红素加氧酶-1(HO-1)等。在多种不同的儿茶素成分中,EGCG是诱导HO-1表达的最有效的诱导剂。硫化铁纳米酶具有较好的自由基清除活性,也含有丰富的亚铁离子,基于此,我们将EGCG与硫化铁纳米酶结合,利用EGCG与铁的螯合作用,发挥更强的清除自由基和细胞保护能力,对AKI也有较好的治疗效果。本论文共分为两个部分,就单独GFeSNs清除ROS治疗AKI和EGCG-GFeSNs清除ROS治疗AKI两个方面展开研究,以下为主要内容:1.GFeSNs作为活性氧清除剂缓解急性肾损伤在AKI进展过程中,过量产生ROS与细胞和组织发生反应,导致不可逆和永久的细胞和组织损伤。因此,清除ROS是治疗AKI的关键。在本章,我们采用溶剂热合成法制备得到了四种硫化铁纳米酶(CFeSNs、DFeSNs、GFeSNs和TFeSNs),通过扫描电子显微镜、多硫化氢释放和超氧自由基(O2·-)的清除效率等实验筛选出了具有小尺寸片层结构的硫化铁纳米酶GFeSNs,实验结果表明,与CFeSNs、DFeSNs和TFeSNs相比,GFeSNs具有最高的多硫化氢释放能力和O2·-清除能力,因此我们选用GFeSNs进行后续实验。高倍透射电镜和元素映射图谱显示,GFeSNs为大小约为200nm的均匀片层结构,主要由Fe和S两种元素组成,与EDS图谱的元素分析一致。X射线衍射图谱和X射线光电子能谱图显示GFeSNs主要由FeS组成。接着,我们进一步详细检测了 GFeSNs的多硫化氢释放能力和各种自由基清除能力,结果表明,GFeSNs对·OH、O2·-、ABTS·+、H2O2和DPPH等自由基有很强的清除能力。细胞实验表明,GFeSNs在浓度为2.5至20 μg/mL的范围内对NRK-52E细胞和HEK293细胞均无毒,并且具有促进细胞增殖的作用。SSP4细胞染色结果显示,GFeSNs产生了大量的多硫化氢并进入细胞。随后,我们评估了 GFeSNs清除ROS保护细胞的能力。结果显示,10 μg/mL的GFeSNs可以使被300 μmol/L H2O2损伤的细胞活力恢复至92%,约84%的细胞能在500 μmol/L的H2O2存在下存活。DCFH-DA染色、线粒体膜电位染色和细胞活死染色实验结果也表明了 GFeSNs清除ROS保护细胞的能力。细胞内炎症因子水平和抗氧化水平检测显示,经过GFeSNs的处理,细胞内TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子水平显著下降,细胞内MDA和GSH也恢复至正常水平。这些结果强烈表明GFeSNs可以在抗炎和清除ROS方面发挥协同作用,以恢复细胞内抗氧化能力,起到保护细胞的作用。随后,我们利用Balb/c小鼠构建AKI小鼠模型探究了 GFeSNs对AKI小鼠的治疗效果。结果显示,GFeSNs可以显著降低AKI小鼠体内CRE和BUN水平,使AKI小鼠体重在短暂降低后持续恢复至正常水平,并且显著延长了 AKI小鼠的存活时间。接着,我们对各组小鼠进行组织水平因子检测,结果显示,通过GFeSNs的治疗,降低了 AKI小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子的释放。与AKI小鼠相比,GFeSNs处理的AKI小鼠中的KIM-1和HO-1水平显著降低。同时,组织水平SOD、MDA、LDH、H2O2和GSH含量也恢复至正常小鼠的水平。我们对小鼠肾脏组织进行病理切片,随后分别进行H&E、DHE和TUNEL染色,发现经过GFeSNs治疗的小鼠肾小管损伤程度减轻,肾组织细胞凋亡和细胞内超氧化物水平减少,与正常小鼠接近。血常规生化分析和主要器官H&E病理切片染色显示,GFeSNs对主要器官无明显毒性,有较高的生物相容性。此外,我们通过WB分析AKI相关蛋白表达发现,经过GFeSNs治疗的小鼠Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达量减少,而Bcl-2蛋白表达量增多,表明细胞凋亡减少;Nrf-2表达量增多,Keap-1表达量减少,表明细胞内抗氧化水平恢复。总之,这些结果清楚地证明了 GFeSNs对AKI的杰出治疗性能,使其成为AKI以及ROS相关疾病的潜在候选者。2.EGCG-GFeSNs缓解急性肾损伤的研究抗氧化剂对AKI导致的炎症和氧化应激具有保护作用,而EGCG是儿茶素中最强的抗氧化成分。在第一章,我们已经证明GFeSNs具有优异的清除自由基能力和细胞保护作用,对AKI也有显著的治疗作用。在本章,我们将EGCG与GFeSNs结合,扫描电子显微镜显示EGCG与GFeSNs结合后,EGCG-GFeSNs的大小形貌并未发生明显变化,仍为200 nm的片层结构。红外光谱显示EGCG与GFeSNs成功结合。细胞实验表明,EGCG-GFeSNs在浓度为2.5至20 μg/mL的范围内对NRK-52E细胞无毒。随后,我们评估了 EGCG-GFeSNs清除ROS保护细胞的能力。结果显示,2.5μg/mL的EGCG-GFeSNs就能使被30stent graft infection0 μmol/L H2O2损伤的细胞活力恢复80%以上,5μg/mL的EGCG-GFeSNs能使被300 μmol/L H2O2损伤的细胞活力恢复90%以上。DCFH-DA染色此网站、线粒体膜电位染色和Calcein AM/PI染色也表明了 EGCG-GFeSNs比GFeSNs具有更优异的清除ROS保护细胞的能力。溶血实验结果显示80μg/mL EGCG-GFeSNs溶血率低于5%,表明EGCG-GFeSNs有较高的生物相容性。这些结果均表明EGCG-GFeSNs比GFeSNs拥有更优异的清除ROS能力,保护细胞作用更强。接着,我们探究EGCG-GFeSNs对甘油致AKI小鼠的体内治疗效果。结果显示,250μg/kg EGCG-GFeSNs可以显著降低AKI小鼠体内CRE和BUN水平,AKI小鼠的体重在第4天开始上升,并持续恢复至正常水平,AKI小鼠的存活时间也显著延长。而用250μg/kg GFeSNs治疗后,AKI小鼠体内CRE和BUN仍处于较高水平,并且有AKI小鼠死亡。接着,我们对各组小鼠进行组织水平因子检测,结果显示,通过EGCG-GFeSNs的治疗,AKI小鼠体内IL-6和IL-1β等促炎因子的释放减少,肾损伤标志物KIM-1和HO-1水平显著降低。同时,组织水平SOD和GSH含量也恢复至正常小鼠的水平MS-275小鼠。而GFeSNs治疗组的肾组织因子含量仍处于较高水平。我们对小鼠进行H&E、DHE和TUNEL染色发现,经过EGCG-GFeSNs治疗的小鼠肾组织损伤减少,肾组织细胞凋亡和细胞内超氧化物水平减少,与正常小鼠接近。主要器官H&E染色显示,EGCG-GFeSNs对主要器官无明显毒性,有较高的生物相容性。这些结果表明,将EGCG与GFeSNs结合后清除ROS能力显著提高,对AKI也表现出更好的治疗效果。