胞内菌在是临床上细菌性感染反复发生,迁延不愈的主要原因,它们存活于宿主细胞中,由于宿主细胞膜的屏障作用阻碍抗生素渗透入胞内而很难有效清除,还会干扰宿主细胞先天免疫反应,抗生素耐药菌株的出现加剧了这一问题,甚至造成威胁生命的感染。目的:本实验旨在开发一种可控载药的纳米颗粒,能够将抗生素递送入细胞内,增加细胞内有效抗生素浓度,并且能打破免疫抑制增强宿主细胞自身的先天免疫,为临床胞内菌的治疗提供一种新思路。方法:(1)使用水解-沉淀法合成内核CaO_2-万古霉素纳米颗粒(CaO_2-Vanco NPs,CV NPs),挑选合适比例的月桂酸、硬脂酸共晶混合物,作为热响应相变的外壳,以合成在理想的熔点可控释放的CaO_2-Vanco@PCM NPs(Canagliflozin纯度CVP NPs)。利用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、X射线衍射图谱(XRD)和傅里叶红外变换光谱(FI-TR)等对CVP NPs的形貌结构进行表征;使用共聚焦荧光显微镜(CLSM)和流式细胞仪进行荧光共定位分析。(2)检测CVP NPs在不同pH和温度下释放万古霉素的速率;使用冷-热循环释药和96孔板释药实验检测CVP NPs释放万古霉素的时间分辨性和空间分辨性;与RAW 264.7细胞不同温度下共培养,评估CVP NPs在细胞水平的热响应释药效果;并使用氧电极评估释氧效率。(3)使用CCK-8、细胞形态荧光成像及溶血试验检测不同浓度梯度的纳米颗粒在37℃到40℃对RAW 264.7细胞与L-929细胞生长活性的影响。(4)通过菌落平板计数、FDA/PI活死染、流式细胞术和SEM成像评估CVP+HTD(CVP+Heated Treatment)处理组对浮游细菌的杀伤情况。使用FDA/PI活死染CLSM荧光成像及SEM成像评估CVP+HTD对生物膜的破坏。(5)建立MRSA感染的RAW 264.7模型,通过荧光成像技术和流式细胞术评估CVP NPs入胞效率;使用裂解细胞细菌后平板计数及CLSM荧光成像评估CVP+HTD清除胞内菌效果。(6)检测不同处理组细胞内乳酸和H~+,评估CVP+HTD去酸化porous media效果;使用蛋白质印迹(Western Blot,WB)检测各组细胞内i NOS、Arg-1和HIF-1α的表达量,判断巨噬细胞的极化状态;检测巨噬细胞内主要抗菌物质活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)的产量。(7)验证CVP+HTD在体内清除胞内菌的效果,使用BABL/c小鼠,建立化脓性关节炎模型,通过观察关节局部的红肿、关节破坏;关节间隙X线片中的骨质黏连;冷冻切片荧光成像中胞内菌的清除情况以及组织石蜡染色结果评估体内治疗效果。结果:(1)合成的CV NPs是尺寸均一,分散性良好的球形结构;合成的CVP NPs具有高稳定性的球形核壳结构,以CV NPs为内核,脂肪酸为外壳。(2)万古霉素在CVP NPs中的负载率约为56.39%。IACS-010759体内实验剂量具有很好的释氧效果,在高温(40℃)和低pH环境下会加速万古霉素的释放,CVP NPs释药具有很高的时间分辨率和空间分辨率,并且这一特性在细胞水平也能保持。(3)在与不同组份纳米颗粒在40℃下共培养后的RAW 264.7及L-929细胞存活率均大于90%,所有组溶血百分比介于1.46-4.96%,均小于5%,表明CVP NP具有良好的细胞相容性和血液相容性。(4)CVP+HTD的对浮游MRSA的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)分别为3.90μg/m L和7.80μg/m L,显著小于不加热组。即使初始细菌密度达到10~8CFU/m L,相当于MIC测定的100倍,CVP+HTD的杀菌率也超过99%,且具有较高的生物膜破坏效果。(5)在CVP+HTD处理下,能高效实现万古霉素的跨膜运输并通过热响应相变按需释放,增加胞内有效杀菌浓度,几乎所有的细胞内MRSA(>99%)都被杀死,并且没有产生抗生素耐受性。(6)CVP+HTD可以通过与周围的水和H~+发生氧化还原反应,产生Ca(OH)2,与乳酸发生酸碱中和反应,消耗积累的乳酸,通过杀伤胞内MRSA减少与细菌代谢物相关的乳酸的产生,克服乳酸相关的免疫抑制,促进巨噬细胞M1极化。(7)体内实验表明CVP+HTD治疗组可以有效地消除关节滑液和滑膜中的浮游MRSA和细胞内MRSA,并能逆转病灶局部的免疫抑制。经过CVP+HTD治疗的小鼠,预后更好且具有优异的组织相容性,提供了一种有前景的治疗胞内菌的策略。结论:CVP NPs具有优异的热响应释药性能,并有效中和乳酸,减轻乳酸相关免疫抑制增加ROS和RNS的产出,为胞内菌治疗提供了一种安全有效的方案。