帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是以黑质多巴胺能神经元死亡丢失和神经元内α-突触核蛋白(alpha-Synuclein,α-Syn)聚集为基本病理改变的中枢神经退行性疾病。目前我国帕金森病的患病率正处于急剧上升的阶段,将会给整个社会带来严峻的挑战。PD的发病机制复杂涉及多种途径和机制,异常的selleck化学蛋白质动力学,线粒体功能障碍,神经炎症等会促进PD发展。研究发现PD神经炎性损伤与过度活化的小胶质细胞有密切联系。过度激活状态下的小胶质细胞会产生炎症因子引发神经炎症反应,进而导致多巴胺能神经元退化死亡。研究发现NOD样受体蛋白-3(nod like receptor family,pyrin domain-containing 3,NLRP3)介导的神经炎症可引起的多巴胺能神经元死亡。NLRP3炎症小体主要由凋亡相关效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,Caspase-1)、接头蛋白凋亡相关的点状蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC)以及NLRP3组成。NLRP3炎症小体是存在于小胶质细胞中的一种炎症复合体。它的激活促进炎症细胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-18(Interleukin-18,IL-18)的分泌,使小胶质细胞破裂,进一步释放IL-1β,损害多巴胺能神经元。因此,对小胶质细胞介导的神经炎症反应进行干预并抑制NLRP3炎症小体可能是防治PD的潜在措施。黑种草籽性味辛、温、甘,具有补肾健脑、通经、解毒利尿之效。百里醌(Thymoquinone,TQ)是黑种草籽挥发油中的活性成分,有抗氧化、抗炎和抗惊厥作用。课题组前期研究发现,TQ可激活Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)通路上调抗血红素加氧酶1蛋白的表达,减少神经元凋亡,延缓PD的发生。为进一步验证TQ对PD神经炎症的治疗作用及可能的相关机制,本研究通过构建体外、体内PD模型,以探究TQ改善PD神经炎性损伤的作用机制。第一部分百里醌对MPTP诱导的PD小鼠模型神经保护作用目的:观察百里醌对PD小鼠模型运动功能损伤的作用,验证百里醌对PD多巴胺能神经元的保护作用。方法:采用旷场实验、转棒实验评价各组小鼠的运动功能;免疫组化检测各组小鼠黑质区酪氨酸羟化酶TH、α-Synuclein表达量;运用Western Blotting法分析各组小鼠TH、α-Synuclein蛋白表达情况;FJB染色观察各组小鼠神经元变性情况;结果:1.百里醌改善PD小鼠运动功能损伤:旷场实验结果显示:与对照组相比,模型组中央路程与中央时间减少,边上路程与边上时间增加(P<0.01);与模型组比较,模型+TQ组中央路程与中央时间显著高于模型组,边上路程与边上时间低于模型组(P<0.05)。转棒实验结果显示:与对照组相比,模型组小鼠的在棒时间显著减少,与模型组比较,模型+TQ组小鼠在棒时间显著增加(P<0.01)。2.百里醌减轻MPTP诱导的PD小鼠多巴胺能神经元缺失:免疫组化结果显示,与对照组相比,模型组小鼠的TH阳性神经元胞体和纤维稀疏,TH阳性神经元显著减少(P<0.01)。与模型组相比,模型+TQ组TH阳性神经元及纤维相对增多(P<0.01)。Western Blotting结果显示:与对照组相比,模型组TH蛋白表达显著减少(P<0.01);与模型组相比,模型+TQ组TH蛋白表达显著增加(P<0.01)。3.百里醌降低了MPTP处理PD小鼠的α-Synuclein水平:免疫组化的结果显示,与对照组相比,模型组α-Syn水平显著增加(P<0.01);与模型组相比,模型+TQ组显著降低了小鼠α-Syn的水平(P<0.01)。Western Blotting结果显示,与对照组相比,模型组α-Syn蛋白水平显著增加(P<0.01);与模型组相比,模型+TQ组显著降低了α-Syn蛋白水平(P<0.01)。4.百里醌对PD小鼠模型神经元损伤的改善作用:FJB染色结果显示:与对照组相比LY-188011 IC50,模型组变性神经元表达显mid-regional proadrenomedullin著增加(P<0.01);与模型组相比,模型+TQ组变性神经元表达显著减少(P<0.01)。结论:百里醌可减轻PD小鼠模型运动功能障碍,改善PD小鼠运动功能损伤及DA神经元缺失。第二部分百里醌对PD细胞模型神经炎性损伤的改善作用目的:观察TQ对PD体外模型的神经保护作用。方法:MTT检测MPP~+对BV-2、SH-SY5Y细胞增殖的影响;MTT检测TQ对条件培养SH-SY5Y细胞增殖的影响;TUNEL法检测条件培养SH-SY5Y细胞凋亡率;Western Blotting法检测条件培养SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白。结果:1.MPP~+干预BV-2、SH-SY5Y细胞的最适条件:MTT结果显示,100μM MPP~+处理BV-2细胞8h对细胞活力影响较小且显微镜下观察到BV-2细胞活化状态,选择该浓度MPP~+处理细胞。进一步用100μM MPP~+直接或间接处理SH-SY5Y细胞24h,BV-2细胞干预后可显著降低SH-SY5Y细胞存活率(P<0.01)。2.百里醌可减轻MPP~+条件培养对SH-SY5Y细胞的损伤:与对照组比较,模型组SH-SY5Y细胞生存率显著减小(P<0.01)。与模型组比较,TQ组SH-SY5Y细胞生存率显著增大(P<0.01)。3.百里醌可降低MPP~+条件培养SH-SY5Y细胞凋亡率:TUNEL染色结果提示,与对照组相比,模型组凋亡的SH-SY5Y细胞数量显著增多(P<0.01),与模型组比较,TQ组凋亡的SH-SY5Y细胞显著减少(P<0.01)。4.百里醌对MPP~+条件培养SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的影响:与对照组比较,模型组Bcl-2/Bax值减小、Caspase-3表达增多(均P<0.01);与模型组比较,TQ组Bcl-2/Bax值增大、Caspase-3表达减少(均P<0.01)结论:百里醌可减轻BV-2细胞诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡,改善PD细胞模型神经元的损伤。第三部分百里醌抑制PD模型NLRP3炎症小体激活及小胶质细胞活化目的:观察NLRP3炎症小体对PD模型神经损伤的作用,探讨百里醌发挥神经保护作用的可能机制。方法:RT-q PCR分析炎症因子TNF-α、IL-6、IL-18 m RNA的表达情况。RT-q PCR分析NLRP3炎症小体相关基因的表达情况。ELISA检测炎症因子IL-1β的表达。Western Blotting法检测PD模型NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。结果1.百里醌对PD小鼠模型炎症因子TNF-α、IL-18、IL-6 m RNA相对表达量的影响:与对照组相比,模型组炎症因子TNF-α、IL-18、IL-6 m RNA的相对表达量显著上调(均P<0.01);与模型组相比,模型+TQ组TNF-α、IL-18、IL-6 m RNA的相对表达量显著下调(均P<0.01)。2.百里醌抑制PD小鼠模型NLRP3炎症小体的激活:Western Blotting结果显示,与对照组比较,模型组NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β蛋白表达水平显著升高(均P<0.01),TQ干预后,NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平显著降低(均P<0.01)。PCR结果显示,与对照组相比,模型组NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1βm RNA的相对表达量显著上调(均P<0.01);与模型组相比,模型+TQ组NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1βm RNA的相对表达量显著下调(均P<0.01)。3.百里醌降低PD细胞模型炎症因子IL-1β表达:与对照组相比,模型组炎症因子IL-1β表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,TQ组可显著降低IL-1β表达(P<0.01)。4.百里醌抑制PD细胞模型NLRP3炎症小体的激活:与对照组比较,模型组NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β蛋白表达水平显著升高(均P<0.01),与模型组比较,TQ组NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β蛋白表达水平显著降低(均P<0.01)。结论:百里醌通过抑制NLRP3炎症小体的激活,减轻炎症因子的表达,抑制小胶质细胞的活化进而保护多巴胺能神经元。第四部分百里醌通过Parkin依g途径促进PD细胞模型受损线粒体的自噬清除目的:观察TQ对PD细胞模型线粒体损伤的保护作用。方法:Western Blotting实验检测线粒体自噬相关蛋白P62、LC3、Parkin、PINK1的表达情况。结果:与对照组比较,模型组P62蛋白表达水平显著升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低,Parkin、PINK1蛋白表达水平明显降低(均P<0.01);与模型组比较,TQ组P62蛋白表达水平显著降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高,Parkin、PINK1蛋白表达水平明显升高(均P<0.01);与TQ组比较,TQ+抑制剂组(CQ)P62蛋白表达水平显著升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低,Parkin、PINK1蛋白表达水平明显降低(均P<0.01)。结论:百里醌可能通过促进线粒体自噬清除,减轻神经炎症,对多巴胺能神经元损伤有保护作用。