背景登革热(Dengue fever,DF)是登革病毒(Dengue virus,DENV)感染引起的急性病毒性传染病,可导致重症登革热(Severe dengue,SD),已经成为严重的全球公共卫生问题。DF可伴有肾脏损伤表现,急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是重要且关注较少的并发症之一。2013年国际肾脏病协会提出了“0 by 25”计划,希望到2025年全球范围内提高对AKI的诊断和治疗,将AKI可预防的病死率降至零。随着成年DF患者报告的增加,AKI病例在不断增加。AKI可导致DF患者的病死率增加和住院天数延长,显著提升治疗难度。研究显示,部分危险因素可增加DF相关AKI的发生风险,如年龄、糖尿病、使用肾毒性药物和SD等。DF相关AKI的发病机制尚不完全清楚,可能与病毒直接损伤、宿主免疫反应、血流动力学改变和横纹肌溶解等有关。然而,由于临床样本量和研究手段的限制,国内外关于DF相关AKI的研究并不多,尤其是早期诊断、风险预测及发病机制等研究少见。鉴于中国DF患者的临床及实验室特征与东南亚等地方性流行区不同,因此,有必要针对我国DF患者开展AKI发生的早期识别及发病机制的研究。目的本课题拟通过临床和基础研究,明确DF相关AKI的临床特征及其危险因素,构建可行的辅助诊断模型,筛选有效的诊断血浆蛋白生物标志物,评估登革病毒分离株感染AG129小鼠模型作为其研究基础的可能性,并尝试从病毒和宿主的角度揭示其可能的发病机制,为早期诊断、预防和治疗提供基础,有助于解决DF相关AKI高病死率的难题。方法1.选择2013年-2019年广东省住院的成年(年龄≥18岁)实验室确诊的DF患者作为研究对象,收集患者的临床资料进行分析。研究对象分为两部分进行分析,一部分为1460例来自广州医科大学附属市八医院的DF患者(包括普通登革热和SD),另一部分为242例来自广东省多中心的SD患者。参照改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease:Improving Global Outcomes,KDIGO)指南的AKI诊断标准,将患者分为AKI组和非AKI组。统计DF患者的AKI的发生率,比较AKI组与非AKI组的临床资料。采用多因素logistic回归分析AKI的独立危险因素,计算优势比值(Odds ratio,OR)及95%置信区间(Confidence interval,CI),并构建辅助诊断模型。采用受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线下面积(Area under curve,AUC)评估其诊断能力。采用Kaplan-Meier生存曲线比较伴与不伴AKI患者之间的生存率。2.纳入1501例成年实验室确诊的DF患者,根据AKI发生分为AKI组及非AKI组,收集或检测患者入院1-2 d的血清DENV特异性Ig M/G抗体、非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)抗原、核酸、DENV-1病毒载量、血清分型、免疫状态和病毒分离培养并测序。通过1:5最邻近匹配法进行匹配,比较匹配前后不同的血清学和病毒学指标与AKI发生的相关性,采用logistic回归分析结合ROC曲线分析评估其优化辅助诊断模型的能力。3.纳入126例成年实验室确诊的DF患者入院1-2 d内血浆样本,排除标准为发病到AKI发生>7 d和合并慢性肾脏病患者。选择66例登革热患者(AKI组12例,SD组17例,DF组37例)和23例对照组血浆,使用数据非依赖采集定量蛋白组学,采用蛋白比值>1.2或<0.7倍,并且同时满足P<0.05的标准筛选差异表达蛋白质。使用基因本体(Gene ontology,GO)、Reactom数据库进行差异表达蛋白质的生物学功能注释及信号通路的富集。再利用60例登革热患者(AKI组20例和非AKI组40例)和18例对照组血浆,采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆差异蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、白细胞介素18(Interleukin 18,IL-18)和肾损伤分子-1(Kidney injury molecule-1,KIM-1)等既往报道的AKI生物标志物。比较各组间的表达差异,利用ROC曲线评估生物标志物对DF相关AKI的诊断价值。4.利用8周龄AG129雌鼠,采用腹腔注射方式注射1×10~6 PFU的4株DENV-1临床分离株进行攻毒。攻毒后1 d开始进行症状观察,检测血清DENV核酸、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(Serum creatinine,SCr)水平,攻毒后3 d检测肾脏的DENV核酸,攻毒后9 d检测肾脏的白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-18水平,并对肾脏进行组织病理学分析。结果1.纳入1460例成年DF患者分析,40例(2.74%)伴有AKI,其中1期占57.50%,2期占22.50%,3期占20.00%。AKI组的重症率、住院天数延长率以及病死率明显高于非AKI组(P均<0.05)。多因素logistic回归分析显示高龄[OR(95%CI)=1.049(1.024-1.074),P<0.001]、高乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)水平[OR(95%CI)=1.001(1.000-1.001),P=0.039]、蛋白尿[OR(95%CI)=3.150(1.398-7.097),P=0.006]textual research on materiamedica、SD[OR(95%CI)=15.931(6.990-36.31),P<0.001]是DF相关AKI的独立危险因素。基于有统计学差异的基线资料指标纳入logistic回归分析结果,结合相关性分析,构建辅助诊断模型logit P=0.060×年龄+0.014×CRP+0.910×血尿(是为1,否为0)+1.186×蛋白尿(是为1,否为0)-8.477。ROC曲线显示,辅助诊断模型的AUC为0.854,敏感度为75.70%,特异度为85.30%。2.纳入242例成年SD患者分析,85例(35.12%)伴有AKI,其中37例(43.53%)为1期、16例(18.82%)为AKI 2期,32例(37.65%)为AKI 3期。Kaplan-Meier分析显示AKI组的病死率明显高于非AKI组(P<0.001)。经校正后,SD伴AKI 1期、2期、3期患者的死亡风险分别增加2.564、2.876、10.767倍。多因素logistic回归分析显示,合并高血压[OR(95%CI)=2.031(1.098-3.756),P=0.024]、接受肾毒性药物治疗[OR(95%CI)=1.902(1.004-3.602),P=0.048]、呼吸过速[OR(95%CI)=4.149(1.787-9.632),P=0.001]、高国际标准化比值(International normalized ratio,INR)水平[OR(95%CI)=6.439(1.889-21.949),P=0.003]和血尿[OR(95%CI)=2.117(1.135-3.949),P=0.018]是SD相关AKI的独立危险因素。3.匹配前DENV Ig M抗体阳性与阴性患者的AKI发生率有统计学差异(2.63%vs.9.61%,χ~2=23.329,P<0.001);二次感染与初次感染患者的AKI发生率有统计学差异(6.45%vs.3.11%,χ~2=5.456,P=0.020);匹配后AKI组与非AKI组之间比较,DENV Ig M抗体阳性率和二次感染率无明显统计学差异。匹配前后DENV Ig G抗体、NS1抗原、血清分型、核酸结果、DENV-1的病毒载量无统计学差异(P均>0.05)。DENV-1基因Ⅰ型与基因V型患者的AKI发生率分别为8.24%、27.78%,差异有统计学意义(χ~2=7.998,P=0.005)。DENV Ig M抗体联合辅助诊断模型的诊断AUC大于单独辅助诊断模型,AUC分别为0.822、0.787。4.定量蛋白质组学分析显示,AKI组与对照组之间共鉴定了239个差异蛋白,其中236个丰度上调,3个丰度下调,Reactom分析显示主要参与新陈代谢、先天免疫系统、中性粒细胞脱颗粒等;AKI组与SD组之间共鉴定了16个上调的差异蛋白,Reactom分析显示主要参与先天免疫系统、细胞因子信号传导等。AKI组与对照组以及SD组的差异蛋白selleckchem C59共筛选7个特异性蛋白:S100钙结合蛋白A12(Protein S100-A12,S100A12)、S100钙结合蛋白A11(Protein S100-A11,S100A11)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(6-phosphogluconolactonase,PGLS)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(Phosphogluconate dehydrogenase,PGD)、氨基甲酸酯磷酸合成酶1(Carbamoyl-Phosphate Synthase 1,CPS1)、腺苷高半胱氨酸水解酶(S-Adenosylhomocysteine hydrolase,AHCY)和免疫球蛋白-κ1-5(Immunoglobulin kappa variable 1-5,IGKV1-5)。ELISA验证分析,与对照组或非AKI组相比,AKI组的S100A12、NAGL、IL-18水平明显升高(P均<0.05)。S100A11和KIM-1水平在各组间无明显差异(P均>0.05)。ROC曲线显示,S100A12、NAGL、IL-18的AUC分别为0.721、0.899、0.722。5.与对照组比较,实验组小鼠可见部分发病表现、体质量下降、血清DENV核酸阳性。部分实验组小鼠可见血Antineoplastic and I抑制剂清BUN和SCr水平升高、肾脏指数升高,肾脏DENV核酸阳性、IL-10和TNF-α表达升高。肾脏病理分析结果显示部分实验组小鼠有轻度病变,主要表现为结缔组织轻度增生,可见少量的炎性细胞浸润。结论本研究首次围绕登革热相关急性肾损伤的早期识别和发病机制,从临床、实验室及小鼠模型等多层次开展研究。重症登革热患者约三分之一发生急性肾损伤,与合并高血压、呼吸过速、高INR水平、血尿和接受肾毒性药物治疗等有关;基于人口学资料及实验室指标,构建辅助诊断模型有助于早期识别;鉴定S100A12等三种潜在诊断的血浆生物标志物;登革病毒分离株感染AG129小鼠模型能为其研究提供基础;宿主免疫应答过激在其发生中可能起着重要作用。本文有助于为登革热相关急性肾损伤的早期诊断和发病机制提供新的证据和研究思路,为指导登革热个体化治疗提供重要依据。