玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)在全球广泛分布,并常常与马铃薯Y病毒科的病毒复合侵染引起玉米致死性坏死病(Maize lethal necrosis disease,MLND),严重威胁全球玉米产业。李痘病毒(Plum Pox virus,PPV)是侵染核果树的最具破坏性的病毒,造成世界核果产业的巨大经济损失。建立特异灵敏、便捷实用的检测技术对MCMV和PPV的检验检疫与防控具有重要意义。本研究分别制备了PPV和MCMV的单克隆抗体,并基于单克隆抗体建立了检测这两种病毒的Dot-ELISA方法和胶体金免疫层析试纸条,为MCMV和PPV的检验检疫与检测提供了技术与工具。1、MCMV单克隆抗体及其胶体金免疫检测试纸条技术以MCMV粒子Microbial ecotoxicology为抗原,通过杂交瘤技术筛选获得6株分泌抗MCMV单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株,并制备其单克隆抗体腹水。Western blot分析发现,6个单克隆抗体均能特异性地识别MCMV的外壳蛋白;Dot-ELISA分析表明,6个单克隆抗体均仅对MCMV感染的玉米植物有免疫反应,而不与其他5种被测植物病毒和未感染的玉米植物有交叉免疫反应,且6个单克隆抗体检测MCMV侵染的玉米植物组织的检测下限可达到1:10,240倍稀释(重量/体积,g/m L),即相当于0.20μg感染的植物组织,是常规RT-PCR方法灵敏度的13倍。利用6个单克隆抗体两两配对组合研究了检测MCMV胶体金免疫层析试纸条技术,发现17C4单克隆抗体作为胶体金标记抗体,7B12单克隆抗体作为检测线(T线)的捕获抗体时,试纸条的检测效果最佳。该胶体金试纸条可以特异性地检测玉米植株中的Protein Tyrosine Kinase抑制剂MCMV,而检测其他5种植物病毒及非感染的健康玉米植物组织均呈阴性反应,检测MCMV感病玉米植物的检测下限达到1:25,600倍稀释(重量/体积,g/m L),相当于2.34μg发病玉米叶片组织,检测灵敏度比常规RTPCR法稍灵敏,说明该胶体金试纸条检测MCMV具有极高的特异性和灵敏度。通过云南采集、海关口岸截获及实验室摩擦接种的玉米病样品进行建立的DotELISA、试纸条和RT-PCR检测,进一步验证了所建立的Dot-ELISA和胶体金测试条的检测有效性。2、PPV单克隆抗体及其胶体金免疫检测试纸条技术以病毒粒子作为抗原,经杂交瘤技术获得了6个抗PPV的鼠源单克隆抗体。Western blot分析发现6个单克隆抗体均能识别PPV衣壳蛋白;Dot-ELISA分析表明,6个PPV单克隆抗体均仅对PPV有特异性免疫反应,而与其他6种分析的植物病毒和非感染的梅树叶片没有交叉免疫反应,6个单克隆抗体检测PPV感染梅树叶粗提物的灵敏度均可达1:5120倍稀释(重量/体积,g/m L),即检测灵敏度相当于0.39μg感染的梅树叶片组织,比常规RT-PCR法检测灵敏度高26倍。利用6个单克隆抗体进行两两配对组合开发了PPV胶体金免疫检测试纸条技术,结果发现,以4A11单克隆抗体作为胶体金标记抗体,13H4单克隆抗体作为T线的PPV捕获抗体时,效果最佳。建立的试纸条仅能特异性检测PPV感染的叶片,而检测其他6种分析的植物病毒和非感染的叶片呈阴性反应,并其检测病叶的稀释下限可达1:6400倍稀释(重量/体积,g/m L),即相当于10.5μg感染的梅树叶片组织,比常规RT-PCR方法的检测灵敏度略高,说明该胶体金试纸条检测PPV具有非常好的特异性和灵敏度。通过野外采集的梅树叶片样品进行Dot-ELISA、试纸条和RT-PCR检测,进一步验证BI 10773了所建立的Dot-ELISA和胶体金测试条的检测有效性。