目的:狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)最常见且最严重的并发症之一。足细胞与内皮细胞之间的相互作用可促进内皮细胞损伤,进而加重LN的发生发展。本研究拟以人肾小球足细胞(human glomerular podocyte,HPC)、人肾小球内皮细胞(human renal glomerular endothelial cell,HRGEC)及BALB/c小鼠为研究对象,制备LN体内外模型,通过抑制足细胞外泌体分泌、敲低外泌体中高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Box-1 Protein,HMGB1)水平,观察内皮细胞损伤是否改善,为进一步阐明狼疮性肾炎的发病机制,探索靶向治疗的方法提供依据。方法:1.检测狼疮性肾炎足细胞分泌的外泌体对内皮细胞的影响1.1以HRGEC为研究对象,检测LN时去除/包含外泌体的足细胞上清对内皮细胞损伤的影响将常规培养的HPC分为健康人血浆刺激组(Control组)、狼疮性肾炎组(LN组),5%健康人或LN患者置换血浆刺激足细胞24 h后,收集培养上清,超高速离心去除外泌体。将常规培养的HRGEC随机分为健康人血浆刺激HPC条件培养基组(Control-medium组)、LN患者置换血浆刺激HPC条件培养基组(LN-medium组)、LN患者置换血浆刺激HPC去外泌体条件培养基组(LN-medium-EXO out组),取上述HPC上清与HRGEC培养基按1:1制配成条件培养基,培养HRGEC 12h,分别收集细胞和培养上清,蛋白印迹技术(western blot,WB)检测VCAM-1蛋白表达,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞上清中VCAM-1和多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1)含量,免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测syndecan-1、ZO-1、F-actin表达,试剂盒检测细Panobinostat胞一氧化氮含量,FITC-BSA法检测细胞通透性。1.2以HRGEC为研究对象,检测LN时抑制足细胞外泌体分泌对内皮细胞损伤的影响将常规培养的HPC随机分为健康人血浆刺激组(Control组)、狼疮性肾炎组(LN组)、LN患者置换血浆刺激+外泌体抑制剂组(LN+GW4869组),LN患者置换血浆刺激+溶剂对照组(LN+DMSO组),10μM GW4869预处理2 h后,给予健康人血浆或LN患者置换血浆刺激24 h,更换为正常培养基继续培养24 h后,收集细胞和培养上清。将常规培养的HRGEC分为常规培养组(Control组)、健康人血浆刺激HPC条件培养基组(C-medium组)、LN患者置换血浆刺激HPC条件培养基组(LN-medium组)、LN患者置换血浆刺激HPC+外泌体抑制剂条件培养基组(LN+GW4869-medium组)、LN患者血浆刺激HPC+溶剂对照条件培养基组(LN+DMSO-medium组),取上述HPC上清与HRGEC培养基按1:1制配成条件培养基,培养HRGEC 12 h,分别收集细胞和培养上清,检测方法及指标同上。2.检测狼疮性肾炎源性足细胞外泌体中HMGB1对内皮细胞损伤的影响将常规培养的HPC分为健康人血浆刺激组(Control组)、狼疮性肾炎组(LN组)、出核抑制剂(Leptomycin B,LMB)+狼疮性肾炎组(LN+LMB组)、溶剂对照+狼疮性肾炎组(LN+ET组),当细胞融合至50%时,以LMB出核抑制剂预处理12 h后,给予LN患者置换血浆刺激36 h,分别收集细胞和培养上清,提取培养上清中的外泌体,western blot检测足细胞及外泌体中HMGB1蛋白表达。LN患者置换血浆刺激HPC,提取其培养上清中的外泌体并用PKH67标记,用PKH67标记的外泌体刺激HRGEC,IF检测外泌体摄入情况将常规培养的HRGEC分为常规培养组(Control组)、健康人血浆源性HPC外泌体组(C-EXO组)、狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN-EXO组)、出核抑制剂+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+LMB-EXO组)、溶剂对照+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+ET-EXO组),加入上述足细胞外泌体刺激12 h,分别收集细胞和培养上清,检测方法及指标同上。将常规培养的HPC分为健康人血浆刺激组(Control组)、狼疮性肾炎组(LN组)、敲低HMGB1病毒感染+狼疮性肾炎组(LN+Sh-HMGB1组)、病毒感染对照+狼疮性肾炎组(LN+Sh-NC组),当细胞融合至50%时感染病毒,孵育24 h,再加入血浆刺激24 h,分别收集细胞和培养上清,提取培养上清中的外泌体,western blot检测足细胞及外泌体HMGB1蛋白表达。将常规培养的HRGEC分为常规培养组(Control组)、健康人血浆源性HPC外泌体组(C-EXO组)、狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN-EXO组)、敲低HMGB1病毒感染+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+Sh-HMGB1-EXO组)、病毒感染对照+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+Sh-NC-EXO组),加入上述足细胞外泌体刺激12 h,分别收集细胞和培养上清,检测方法及指标同上。3.以HRGEC为研究对象,检测狼疮性肾炎源性足细胞外泌体中HMGB1是否通过调节TRIM27表达介导内皮细胞损伤3.1检测LN时足细胞源性外泌体是否调节内皮细胞TRIM27蛋白表达将常规培养的HRGEC随机分为对照组(Control-medium组)、LN患者置换血浆刺激HPC条件培养基组(LN-medium组)、LN患者置换血浆刺激HPC去外泌体条件培养基组(LN-medium-EXO out组)、LN患者置换血浆刺激+GW4869组(LN+GW4869-mrdium组)、LN患者血浆刺激+溶剂对照组(LN+DMSO-medium组),收集细胞,western blot检测TRIM27蛋白表达。3.2检测LN时足细胞源性外泌体中HMGB1是否通过调节TRIM27表达介导内皮细胞损伤将常规培养的HRGEC分为正常对照组(Control组)、健康人血浆源性HPC外泌体组(C-EXO组)、狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN-EXO组)、出核抑制剂+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+LMB-EXO组)、溶剂对照+狼疮肾炎源性HPC外泌体组(LN+ET-EXO组)、敲低HMGB1病毒感染+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+Sh-HMGB1-EXO组)、病毒感染对照+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+Sh-NC-EXO组),收集细胞,western blot检测TRIM27蛋白表达。将常规培养的HRGEC分为病毒感染对照+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+Sh-NCbiomarkers tumor-EXO组)、敲低HMGB1病毒感染+狼疮性肾炎源性HPC外泌体组(LN+Sh-HMGB1-EXO组)、敲低HMGB1病毒感染+狼疮性肾炎源性HPC外泌体+过表达TRIM27组(LN+Sh-HMGB1-EXO+WT-TRIM27组)、敲低HMGB1病毒感染+狼疮性肾炎源性HPC外泌体+转染对照组(LN+Sh-HMGB1-EXO+WT-NC组),细胞融合至50%时,加入WT-TRIM27/WT-NC质粒36 h,再加入上述足细胞外泌体刺激12 h,分别收集细胞和培养上清,检测内皮细胞损伤相关指标,检测方法及指标同上。4.探讨狼疮性肾炎模型小鼠足细胞外泌体中HMGB1对内皮细胞损伤的影响将20只8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为对照组(Control组)、LN模型组(LN组)、LN模型+敲低足细胞HMGB1病毒感染组(LN+Sh-Nphs2-HMGB1-AAV组)、LN模型+病毒感染对照组(LN+Sh-NC-AAV组),采用单次腹腔注射pristane(0.5ml/只)制备LN模型,24周后将重组腺相关病毒(Sh-Nphs2-HMGB1-AAV/Sh-NC-AAV)原位注射至病毒感染组小鼠双侧肾脏,10周后留取血、尿标本,处死小鼠并收集肾脏组织。IF检测转染效率和沉默效果,提取小鼠尿液中外泌体,western blot检测CD63、nephrin、HMGB1表达,HE、PAS进行常规病理学观察,免疫组化技术检测TRIM27、VCAM-1、CD31蛋白在肾组织中的表达,ELISA方法检测小鼠血清syndecan-1、VCAM-1含量,试剂盒检测肾皮质NO水平,生化分析仪检测小鼠血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白等生化指标。结果:1.狼疮性肾炎源性足细胞外泌体介导内皮细胞损伤1.1 LN时足细胞外泌体可介导内皮细胞损伤Western blot结果显示,与Control-medium组相比,LN-medium组肾小球内皮细胞中VCAM-1蛋白表达明显升高,而在LN-medium-EXO out组中VCAM-1蛋白表达降低。IF结果显示,syndecan-1阳性表达位于细胞膜和细胞浆,ZO-1阳性表达位定位于细胞膜,与Control-medium组相比,LN-medium组syndecan-1、ZO-1蛋白表达明显减少,而在LN-medium-EXO out组中syndecan-1、ZO-1表达有所恢复。在Control-medium组中,细胞骨架F-actin沿细胞长轴方向呈细丝状排列,且排列规整,LN-medium组F-actin排列紊乱,呈锯齿状,而在LN-medium-EXO out组中细胞骨架排列有所恢复。同时,与Control-medium组相比,LN-medium组上清中syndecan-1和VCAM-1含量明显升高,细胞中NO含量增高,细胞通透性增强,去除外泌体后条件培养基刺激的内皮细胞上清中syndecan-1和VCAM-1含量降低,细胞中NO含量降低,细胞通透性下降。1.2抑制LN足细胞外泌体分泌可减轻内皮细胞损伤Western blot、免疫荧光、ELISA等结果显示,与Control组相比,Control-medium组内皮细胞未见明显损伤,LN-medium可导致内皮细胞损伤,表现为培养上清中VCAM-1、NO、syndecan-1水平升高、内皮细胞通透性增强、内皮细胞糖萼丢失和排列紊乱,而在LN+GW4869-medium组中内皮细胞损伤减轻。2.狼疮性肾炎源性足细胞外泌体中HMGB1可介导内皮细胞损伤为了进一步确定外泌体HMGB1在HRGECs损伤中的作用,我们通过LMB预处理抑制HMGB1转位,并通过转染sh-HMGB1-LV来敲低HPC细胞中的HMGB1。Western blot结果显示,与Control组相比,狼疮性肾炎组HPC胞浆与外泌体中HMGB1蛋白表达明显升高,而在LN+LMB组HPC胞浆与外泌体中HMGB1蛋白表达降低,并且在LN+Sh-HMGB1组HPC与其外泌体中HMGB1蛋白表达也降低。Western blot、免疫荧光、ELISA等结果显示,与Control组相比,健康人血浆源性HPC外泌体组内皮细胞未见明显损伤,狼疮性肾炎源性HPC外泌体组可导致内皮细胞损伤,表现为培养上清中VCAM-1、NO、syndecan-1水平升高、内皮细胞通透性增强、内皮细胞糖萼丢失和排列紊乱,而在LN+LMB-EXO组与LN+Sh-HMGB1-EXO组中相关内皮损伤标志物如VACM-1、syndecan-1、ZO-1、NO等显著改善。3.狼疮性肾炎源性足细胞外泌体中HMGB1通过上调TRIM27表达介导内皮细胞损伤3.Belumosudil纯度1 LN足细胞外泌体上调内皮细胞TRIM27蛋白表达Western blot结果显示,与Control组相比,Control-medium组TRIM27蛋白表达未见明显变化,LN-medium组TRIM27蛋白表达明显升高,而在LN-medium-EXO out组与LN+GW4869-medium组TRIM27蛋白表达明显减少。3.3 LN足细胞外泌体中HMGB1通过TRIM27介导内皮细胞损伤Western blot结果显示,与Control组相比,Control-EXO组TRIM27蛋白表达未见明显变化,狼疮性肾炎源性HPC外泌体组TRIM27蛋白表达明显升高,而在LN+LMB-EXO组与LN+sh-HMGB1-EXO组TRIM27蛋白表达显著降低。Western blot、免疫荧光、ELISA等结果显示,与LN+Sh-HMGB1-EXO组相比,LN+Sh-HMGB1-EXO+WT-TRIM27组内皮细胞损伤加重。4.在狼疮性肾炎模型小鼠中,足细胞外泌体中HMGB1通过调节TRIM27表达介导内皮细胞损伤与对照组小鼠相比,HE、PAS结果显示,狼疮性肾炎模型小鼠肾小球体积增大,细胞数目明显增多,基底膜明显增厚,系膜区明显增宽;肾小球足细胞中HMGB1蛋白表达明显升高;肾小球内皮细胞中VCAM-1、TRIM27蛋白表达显著升高;小鼠24 h尿蛋白量明显增加;尿中CD63、nephrin、HMGB1表达增高;血清中VCAM-1和syndecan-1含量明显上调;肾皮质中NO水平升高。Sh-Nphs2-HMGB1-AAV可有效减轻肾小球损伤;下调狼疮性肾炎模型小鼠肾小球足细胞中HMGB1蛋白含量;且与狼疮性肾炎模型小鼠组相比,Sh-Nphs2-HMGB1-AAV组小鼠肾小球内皮细胞VCAM-1、TRIM27蛋白表达下降;小鼠24 h尿蛋白量有所降低;尿中CD63、nephrin、HMGB1表达降低;血清中VCAM-1和syndecan-1含量下降;肾皮质中NO水平下降。结论:LN时足细胞外泌体中HMGB1通过上调内皮细胞TRIM27表达介导肾小球内皮细胞损伤。