目的牙周炎是一种以牙菌斑生物膜为始动因素的慢性炎症感染性疾病,如果炎症持续存在,最终会导致牙槽骨的破坏。已知牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)在患者中的检出率较高,并且与牙周炎疾病密切相关。然而,目前还不清楚慢性牙周炎与P.gingivalis感染的病理相关性,特别是炎症反应中的相关性。了解由P.gingivalis诱导炎症应答的分子机制,可以为牙周炎的治疗提供新的思路。环状GMP-AMP合酶(Cyclic GMP-AMP synthasec,cGAS)-干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)通路是机体固有免疫信号的重要组成部分,在宿主抵御外来病原生物感染或触发自身炎症反应中发挥重要作用。本研究通过细胞水平及动物模型研究,分析P.gingivalis对cGAS-STING通路活化及牙周炎发病的影响,以探寻P.gingivalis感染引发牙周炎的可能机制。方法(1)使用P.gingivalis侵染人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts,HGFs),通过检测人牙龈成纤维细胞存活率的影响,活性氧水平,cGAS通路中关键分子(cGAS、STING),炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β),破骨细胞相关分子RANKL的表达变化。(2)构建P.gingivalis感染的实验性牙周炎小鼠模型。观察牙槽骨形态变化和破骨细胞阳性率的改变,检测破骨细胞相关基因(核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)、组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)),检测干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及其他炎症相关基因表达水平;(3)在实验性牙周炎动物模型中使用Micro-CT扫描分析牙槽骨吸收情况,检测P.gingivalis关键蛋白酶(RgpA、KGP)、Ⅰ 型干扰素基因(IFN-β)、RANKL 水平,cGAS、STING 蛋白表达,炎性因子。(4)在STING功能缺陷(StingGt)牙周炎小鼠中,检测牙槽骨炎症细胞浸润情况,炎症因子、IFN-β、RANKL、以及各组小鼠牙龈组织中巨噬细胞极化水平以及趋化因子的变化情况,探究P.gingivalis感染与cGAS-STING通路的活化情况以及Ⅰ型干扰素基因的表达变化。(5)使用STING抑制剂(SN-011)和STING激动剂(SR-717),检测其对P.gingivalis感染诱导的牙周炎In Silico Biology小鼠病情的影响及炎症细胞因子的变化情况。结果(1)细胞水平结果显示:P.gingivalis侵染HGFs 6 h后ROS水平明显高于0 h和4 h;P.gingivalis感染HGFs后,cGAS和STING基因和蛋白表达水平明显上调;同样的,P.gingivalis侵染6h后IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的表达水平显著高于0h和4h;RANKL mRNA水平相比未处理细胞提高了 1.3倍,但没有显著性差异;进一步用Western检测RANKL的表达,结果显示RANKL蛋白的表达水平升高。上述研究结果表明,P.gingivalis的确能够促进HGFs中cGAS-STING通路的活化,并诱导炎性细胞因子的表达。(2)在牙周炎动物模型中,牙周炎小鼠牙龈组织出现炎症,固有层中炎症细胞高度浸润,以及牙槽骨高度的降低和吸收增加均较明显。此外,牙周炎一侧的牙槽骨中,TRAP阳性的破骨细胞数量明显增加;破骨细胞相关基因(CTSK、MMP-ICI 46474配制9、RANKL)及炎症相关基因(IL-1β、IL-6、TNF-α、IF)的表达较对照侧升高(P<0.05);牙周炎模型小鼠的颊侧显示牙槽骨吸收增加,呈筛网状,牙根暴露,牙槽嵴的高度下降,从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离距离增加(P<0.05);P.gingivalis毒力因子(RgpA和KGP)的mRNA表达水平显著升高;牙周炎小鼠牙龈细胞ROS的产生增加;cGAS和STING蛋白的表达明显升高;血清中促炎细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β)的表达水平显著升高;IFN-β的表达水平增加了 5倍;RANKL mRNA水平是对照组的2倍。这些结果表明,P.gingivalis感染激活了 cGAS-STING途径,导致Ⅰ型IFN基因和多种炎症细胞因子的产生,这些炎症因子有助于破骨细胞的分化和激活。(3)在WT和STING功能缺陷(StingGt)小鼠构建牙周炎动物模型。WT牙周炎小鼠有大量的炎症细胞浸润,而STING功能缺陷小鼠只有轻微的反应;STING功能缺陷小鼠分泌的炎症因子水平降低;IFN-β的表达水平降低,降低了 1.6倍;F4/80+巨噬细胞浸润明显增强,CD206+(M2标志物)细胞增加,CD11c+(M1标志物)细胞减少;趋化因子(CCR2和CCL2)水平明显下降;牙槽骨吸收减少;RANKL的表达减少。以上结果表明,在P.gingivalis感染诱导的cGAS-STING信号通路中,STING功能缺失会降低Ⅰ型干扰素基因的表达。(4)用STING抑制剂(SN-011)或激动剂(SR-717)治疗牙周炎小鼠,相较PBS组,SN-011可显著降低炎症细胞因子的产生和破骨细胞的形成(P<0.01);SR-717组牙周炎小鼠STING蛋白的表达水平升高,而SN-011组STING蛋白的表达水平下降;SR-717治疗组的炎症细胞因子水平显著升高(P<0Ferrostatin-1.01),而SN-011治疗组的炎症细胞因子水平显著降低(P<0.01);此外,SN-011治疗组小鼠炎症细胞数量减少,而SR-717治疗组小鼠牙周组织有大量炎症细胞浸润,组织学评分均有明显差异(P<0.01);SR-717治疗组的M1巨噬细胞(CD11c+F4/80+)数量明显增加,M2巨噬细胞(CD206+F4/80+)数量减少,而SN-011治疗组表现出抑制M1巨噬细胞极化和促进M2巨噬细胞极化;SR-717治疗组的趋化因子(CCR2和CCL2)水平明显增加,而SN-011治疗组的趋化因子水平明显下降。以上结果表明,STING抑制剂SN-011可减少P.gingivalis诱导的牙槽骨吸收。结论:以上结果共同证实了我们的假设,即P.gingivalis激活cGAS-STING信号通路,导致随后的促炎症细胞因子和Ⅰ型IFN基因的表达,这些促炎细胞因子增强了巨噬细胞的激活和破骨细胞的生成,从而促进了牙周炎的发病机制。STING的小分子抑制剂SN-011可以减少巨噬细胞的激活,缓解牙槽骨的破坏。这些发现可能有助于我们更好地理解P.gingivalis诱导的牙周炎的发病机制,并为牙周炎的预防和治疗提供线索。