L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid,L-AA)又被称作维生素C(Vitamin C,VC),是一种人体自身无法合成的营养元素,具有高抗氧化性,在人体的生长发育以及各种生理活动中都有着及其重要的作用。由于VC本身的结构极不稳定KD025配制,在一些光、热以及金属离子环境中极易分解,这极大地限制了VC的应用范围。为了增强VC的稳定性,合成了一些VC的衍生物,在这些衍生物中,2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)由于具有较高的稳定性,并且可被人体内α-葡萄糖苷酶重新分解成L-抗坏血酸与葡萄糖,进而发挥出L-抗坏血酸的生理作用,故被认为是L-抗坏血酸的极佳替代品,在食品、医疗、饲料以及化妆品等行业都有着广泛的应用。目前AA-2G主要通过生物法合成,常用的催化酶为环糊精葡萄糖基转移酶简称(CGTase,EC 2.4.1.19),CGTase不仅具有较强的产物特异性而且也具有较高的AA-2G产量,故在目前能催化合成AA-2G的酶中属于应用最广并且研究最多的一种酶。研究发现以环糊精为底物时,CGTase制备AA-2G的产量较高,但是环糊精的成本较高不利于工业化生产,以价格低廉并且易溶于水的麦芽糊精制备AA-2G可以大大降低成本。由于CGTase对麦芽糊精的亲和力较低,故制备AA-2G的产量也较低,可通过对CGTase进行分子改造以提高其对麦芽糊精的亲和力,从而降低成本与更高效地制备AA-2G。本论文以实验室先前构建的编码环糊精葡萄糖基转移酶my20的基因工程菌为研究对象,通过饱和突变对其进行定向改造,提高了其以麦芽糊精和L-AA为底物制备AA-2G的转化率,主要研究内容如下:以实验室先前保藏的重组质粒p ET24a/my20为模板,通过三维结构模拟与序列比对分析确定了突变位点Y260与A236,随后对其进行饱和突变,将表达后的突变体发酵制取粗酶液,并通过镍柱亲和层析的方法进行纯化。以麦芽糊精与L-抗坏血酸为底物制备AA-2G,最终筛选出了两株AA-2G产量提高的菌株:Y260F与A236P,随后又构建了双突变体Y260F/A236P。对MY20以及Y260F/A236P的酶学性质进行测定,MY20的最适反应温度为80℃,Y260F/A236P则在60℃有最大活性,两者的最适反应pH均为7。野生型以及突变体均有良好的热稳定性与pH稳定性,在20℃-80℃的条件下放置2 h后,MY20与Y260F/A236P均能保持90%以上的活性,pH 4-10范围内4℃保温12 h,MY20与Y260F/A236P的环化活力仍能保持在80%以上。Ca~(2+)可以增强MY20与Y260F/A236P的环化活性,而Cu~(2+)则会抑制两者的活性。对野生型以及突变体制备AA-2G的反应温度、pH、酶浓度、底物配比以及反应时间进行优化,MY20、Y260F以及Y260F/A236P的最适反应温度为30℃,A236P的最适温度为40℃,与野生型相比,A236selleck化学P具有更高的反应温度,这可能有助于底物的溶解。MY20以及突变的最适反应pH都为4,最适加酶量都为120 U/g麦芽糊精,最适底物配比为麦芽糊精/L-抗坏血酸=1/3,都在反应24 h获得最大产量。双突变体Y260F/A236P在最优条件下合成AA-2G的产量为30.19 g/L,比野生型CGTase提高了11.85%。对野生型以及突变体进行动力学研究,发现突变体Y260F、A236P、Y260F/A236P的L-抗坏血酸K_m值分别比野生型降低了15.02%、9.36%、28.56%,K_(cat)/K_m分别比野生型提高了43.66%、30.51%、85.91%。结果表明,这些突变体对L-AA的亲和性和催化效率都有所提高。最后,通过同源建模以及分子对接对实验结果进行机理分析。以可溶性淀粉为底物探究MY20与Y260F/A236P的底物特异性,并对底物浓度、加酶量以及反应时间进行优化,最终在加酶量5 U/g淀粉、5%底物浓度下反应24 h后,MY20与Y260F/A236P制备medical-legal issues in pain management环糊精的转化率均达到最高,分别为49.78%与47.46%。结果表明,突变体Y260F/A236P相对于MY20不仅合成AA-2G的产量有所提高,也具有较好的温度稳定性与pH稳定性,在工业化生产中具有较大优势。