高等植物生长发育通常会经历胚胎期,营养生长期及生殖生长期来完成其生命周期。其中,营养生长期由幼年营养生长期和成年营养生长期组成。幼年期向成年期的转变被称为营养生长阶段转变,而成年期向生殖期的转变被称为开花。植物营养生长是生殖生长的基础,同时该发育进程参与调控植物生物量、株型、抗病虫性、抗逆性、不定根产生以及次级代谢产物的合成等多种生理生化过程和重要的农艺经济性状。因此,研究植物幼年向成年阶段转变的分子机制具有重要的理论价值和应用意义。研究表明,植物幼年向成年阶段转变主要由miR156-SPL(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-1IKE)途径调控。尽管人们已经对miR156及其靶基因SPL的转录调控开展了一系列研究,但是对于外界环境因子及上下游因子如何具体参与或整合到miR156-SPL途径来调控植物营养AZD1152-HQPA核磁生长阶段转变的研究却鲜有报道。植物激素参与调控一系列重要的植物生长发育过程。其中,赤霉素(Gibberellin,GA),茉莉酸(Jasmonicacid,JA)及细胞分裂素(Cytokinin,CK)通过整合到miR156-SPL途径来调控植物幼年向成年阶段转变,但是其他激素是否参与该过程仍未见报道。为了发掘和鉴定更多参与植物营养生长阶段转变的调控因子,我们对拟南芥野生型种子开展了EMS诱变,并利用正向遗传学的筛选方法,筛选具有幼年向成年阶段转变表型异常的突变体。其中,我们获得了一份营养生长阶段转变延迟的突变体del2(delayed juvenile-to-adultphasetransition mutant2)。本课题以del2为研究对象,利用遗传学、分子生物学、生物化学及生理学方法对DEL2参与调控植物营养生长阶段转变的分子机理开展了研究,取得了如下结果:1.del2突变体表现出典型的幼年向成年阶段转变延迟的表型:与野生型相比,del2成年叶发生叶位延迟,叶片长宽比变小,叶片发生速率减慢,同时表现出矮化及晚花的表型。图位克隆表明,该突变基因位于Ⅰ号染色体分子标记ciw1和F19K16(A)之间。对候选区DWF5(DWARF5)基因克隆测序结果表明,DWF5基因在开放阅读框(OPEN READING FRAME,ORF)第1848位碱基发生了一个G-A的点突变,导致DWF5蛋白翻译提前终止。转基因回复实验表明突变体缺陷表型是由DWF5突变造成,因此将del2突变体重新命名为dwf5。2.DWF5参与油菜素甾醇(Brassinosteroid,BR)生物合成,编码Δ7甾醇还原酶。对dwf5的激素含量检测结果显示,突变体油菜素内酯(Brassinolide,BL)含量显著低于野生型。外源添加BL可显著回复dwf5阶段转变延迟的表型。3.对dwf5突变体miR156-SPL途径的关键基因转录本检测结果表明,miR1 72 及MIR1 72B 在dwf5 中均显著降低,而SPL3、SPL9、SPL13、TOE1(TARGET OFEAT1)、TOE2含量无显著变化。Western杂交结果显示SPL9蛋白在dwf5中显著降低。利用地塞米松(Dexamethathone,DEX)诱导pSPL9::GR-rSPL9 dwf5转基因材料发现,dwf5中SPL9激活MIR1 72B转录功能受损。Western杂交检测经MG132和CHX处理的pSPL9::3×FLAG-rSPL9 dwf5转基因材料中的SPL9蛋白的结果表明,与野生型相比,SPL9蛋白在dwf5中更不稳定,且通过蛋白酶体途径被降解。4.遗传互作分析表明,在dwf5中过表达MIR1 72B及引入toe1 toe2双突变均可显著回复其下表皮毛延迟的表型,但无法回复其叶圆表型。说明MIR1 72B及TOE1/2作用于DWF5 下游,且dwf5中MIR1 72B的降低是引起其下表皮毛延迟的部分原因,而对dwf5叶形的调控则依赖于其他途径。在dwf5中过表达pSPL9::rSPL9,DWF5突变抑制了 SPL9蛋白促进营养生长阶段转变的功能。5.酵母双杂,BiFC(Bimolecular fluorescence complementation),pull down及 Coimmunoprecipitation(Co-IP)实验证明 BIN2(BR-INSENSITIVE2)与 SPL9和TOE1在体内及体外均存在直接互作。蛋白分析表明,SPL9和TOE1各自存在 BIN2 经典磷酸化修饰位点 TPVKT 和 TKLVT。IP-MS/MS(Immunoprecipitation-mass spectrometry)结果进一步表明,SPL9蛋白第102位氨基酸和TOE1第124位氨基酸在野生型中存在磷酸化修饰,而在bin2-3 bill bil2三突中不存在磷酸化。体外激酶分析证实BIN2能够磷酸化SPL9和TOE1蛋白中上述修饰位点。6.我们在SPL9的TPVKT和TOE1的TKLVT基序中各引入磷酸化不敏感(T-A)和持续磷酸化(T-D)的突变,并获得相关的对miR156和miR172不敏感的转基因过表达株系。表型分析结果表明,T-A突变形式的pSPL9::3×FLAG-rSPL9和Ubi10::3×FLAG-rTOE1转基因植株均表现出最强的营养生长阶段转变表型;T-T未突变形式的转基因植株均表现出居中表型;而T-D突变形式的转基因植株均表现出最弱表型。Western杂交结果表明,T-A突变形式的转基因植物中积累了更多的SPL9和TOE1蛋白,T-T未突变形式则积累了居中水平的蛋白,而T-D突变形式则蛋白积累水平显著降低。该结果说明SPL9与TOE1蛋白中BIN2磷酸化位点的磷酸化状态对于其蛋白稳定性和行使其功能至关重要。7.对dwf5中miR172敏感(sTOE1)和不敏感(rTOE1)TOE1蛋白检测结果表明,与WT相比,rTOE1含量显著降低Hepatic fuel storage,而sTOE1显著增加。这些结果表明,植物同时利用BIN2-SPL9-miR172-TOE1和BIN2-TOE1这两种相互拮抗途径来参与调控植物体内TOE1蛋白的含量,BIN2-SPL9-miR172-TOE1途径比BIN2-TOE1途径更为重要。基于上述结果,我们提出BR整合到miR156-SPL途径调控植物幼年向成年阶段转变的作用模型:在野生型情况下,正常水平的BR抑制了 BIN2对SPL9和TOE1的磷酸化及降解,以维持植物体内正常稳定的TOE1水平来调控营养生长阶段转变;而在dwf5突变体中,BR含量的降低导致BIN2水平升高,并促进其磷酸化和降解 SPL9 和 TOE1,在 BIN2-SPL9-miR172-TOE1 和 BIN2-TOE1 两个途径的共同作用下Telaglenastat,导致TOE1增加,从而使dwf5表现出幼年向成年阶段转变延迟的表型。本研究报道了 BRs作为一种重要的植物激素参与调控植物营养生长阶段转变的新功能,揭示了 BR信号通过BIN2与SPL9和TOE1互作整合到miR156-SPL途径的分子调控网络,为今后研究植物生长发育提供了一种新的模型。