猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性高度接触性胃肠道传染病。近年来,PEDV的广泛流行及高致病性给我国养猪业造成了巨大的经济损失immune memory。目前,相关研究报道汉黄芩素(Wogonin)对冠状病毒主蛋白酶(Main protein,Mpro,又名3CL蛋白酶)表现出较好的抗病毒活性。研究表明,Mphttps://www.selleck.cn/products/smoothened-agonist-sag-hcl.htmlro在PEDV的复制中起着至关重要的作用,已成为抗PEDV药物设计的重要靶点。本试验首先确定了汉黄芩素的抗PEDV活性,并进一步解析其具体的分子机制。试验方法和结果如下:1.汉黄芩素安全用药浓度的筛选:本试验以Vero和IPEC-J2细胞为研究对象,用不同浓度的汉黄芩素(6.25～400μM)3-MA作用处理细胞,48h后收集细胞样本,通过检测CCK-8含量分析汉黄芩素对细胞活力的影响。结果表明,汉黄芩素对Vero和IPEC-J2细胞的安全浓度为6.25～100μM,其CC_(50)值分别为475.3μM和499.4μM。2.汉黄芩素抗PEDV活性研究:以12.5～100μM浓度的汉黄芩素处理感染PEDV的Vero和IPEC-J2细胞,分析汉黄岑素抗PEDV活性。免疫荧光、RT-PCR和病毒载量结果表明,25～100μM浓度的汉黄芩素均极显著抑制PEDV的感染(P<0.01),其IC_(50)值分别为54.87μM和114.55μM。进一步检测汉黄芩素对PEDV复制周期的影响,结果表明汉黄芩素可以显著抑制PEDV的复制(P<0.05),极显著抑制PEDV的内化和释放(P<0.001),并可以直接体外灭活PEDV(P<0.01)。3.汉黄芩素抗PEDV活性的分子机制研究:通过同源建模和分子对接技术发现汉黄芩素能稳定嵌入到Mpro蛋白活性口袋的凹槽中,从而抑制Mpro结合底物。首先通过表达纯化的PEDV-Mpro蛋白与汉黄芩素的体外结合试验,包括差式扫描荧光法(DSF)、微尺度热泳(MST)和表面等离子体共振技术(SPR),验证了汉黄芩素与PEDV-Mpro之间的稳定性和中等亲和力;其次荧光共振能量转移分析技术(FRET)验证了表达纯化的PEDV-Mpro蛋白的酶活并证实汉黄芩素能够抑制PEDV-Mpro酶活性。综上:汉黄芩素表现出对PEDV的抗病毒活性,能够显著抑制PEDV内化、复制和释放,同时能够直接体外灭活PEDV。通过靶向PEDV-Mpro蛋白底物结合位点抑制Mpro酶活性介导PEDV感染。本研究为深入了解汉黄芩素的抗病毒活性以及抗PEDV药物的研究提供了新方向。