细菌耐药性已然成为目前畜牧业最紧急的问题,特别是环境中广泛存在的革兰氏阴性菌,是动物感染的主要病原菌。但由于抗生素被大量的不合理应用,以及动物养殖领域中抗生素饲料添加剂的长期使用,耐药菌逐渐出现甚至发现许多多重耐药medical treatment菌,导致抗菌药物抑菌效率逐渐减弱。因此当务之急是寻找新型抗菌药物及抑菌方法,但由于新型抗菌药物的研发成本高,耗时长,所以寻找新型抗菌增效剂已然成为近期研究热点。抗菌肽因具有特异性杀菌,不易产生耐药性等特点,被认为是新型抗菌药物及增效剂的理想来源。本研究旨在通过从课题组前期构建的抗菌肽库中筛选可抑制多重耐药革兰氏阴性菌的抗菌增效剂,探究DNA Damage/DNA Repair抑制剂其在动物体内的治疗效果,初步研究其作用机制,主要试验内容如下:(1)本试验从课题组前期设计合成的抗菌肽库中筛选对多重耐药革兰氏阴性菌具有抗菌活性的新型抗菌增效剂,将其与6种临床常用抗生素联用后以期恢复多重耐药的革兰氏阴性菌对抗生素的敏感性,最终成功筛选出一种氨基糖苷类的抗菌增效剂OM19r,可以恢复5种多重耐药的革兰氏阴性菌对庆大霉素(Gentamicin,GEN)的敏感性,其中对大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)B2的协同效果最好,FIC可达0.157。当OM19r(4μg/m L)联合GEN(1μg/m L)时,对临床分离的60株大肠杆菌的抑菌效率可达到90%。细胞毒性、溶血活性等试验发现当OM19r的浓度≤64μg/m L与GEN(4μg/m L)联合时,细胞存活率>90%,溶血率<10%。另外,通过E.coli B2建立大蜡螟及小鼠感染模型,联合用药治疗组可以将存活率从25-50%提高至80%,并降低小鼠各器官的载菌量4-5个数量级,表现出良好的治疗效果。(2)通过激光共聚焦扫描发现OM19r对E.coli B2的作用部位GSK126 IC50主要是菌体内。膜透化作用机制研究发现,OM19r联合GEN对E.coli B2的细菌外膜,PH梯度,外排泵的功能均没有显著影响,但是会使细菌内ROS积累、膜电位以及质膜通透性发生变化,q PCR检测内膜转运蛋白Sbm A的基因表达量上调,体外表达并添加Sbm A,发现其可以影响OM19r的单独及协同抑菌活性。从分子对接模拟结果分析OM19r与Sbm A蛋白在异亮氨酸的217、47及络氨酸241位点处结合率较高。另外生物膜形成测定试验发现联合用药能抑制E.coli B2生物被膜的形成。(3)DNA凝胶阻滞试验结果显示,当OM19r的浓度≥128μg/m L时与E.coli B2的基因组DNA结合,而OM19r(8μg/m L)与GEN(4μg/m L)联合对E.coli B2的基因组DNA无作用。使用my TXTL?Sigma 70 Master Mix试剂盒检测结果发现GEN单独对EGFP荧光蛋白的表达具有抑制作用,添加OM19r后荧光值下降得更加明显,表明OM19r可以影响蛋白质的合成。体外构建转录及翻译体系,结果发现OM19r对体外转录无影响,但是会抑制mRNA的翻译,且抑制翻译的延伸。总之,本研究成功筛选出氨基糖苷类庆大霉素的抗菌增效剂OM19r,初步探究其协同抑菌机制,该研究将为治疗多重耐药菌提供了新思路,亦推动了抗菌肽作为抗菌增效剂应用于细菌性疾病的研究进展。