心血管疾病是人类的头号死因,血栓的形成是心血管疾病的主要发病机制之一。动脉血栓的形成依赖于血小板的活化和聚集,而血小板膜上的P2Y_(12)受体在血小板活化和聚集的过程中起关键作用。临床上广泛应用的P2Y_(12)受体不可逆抑制剂氯吡格雷为前体药物,本身没有活性,在体内需要经过两步CYP450酶的代谢活化,其中CYP2C19具有基因多态性,导致其治疗效果产生个体差异。此外,氯吡格雷的活化效率较低。后续上市的普拉格雷虽然解决了氯吡格雷的两方面缺陷,但是却增加了致命的出血风险。针对氯吡格雷及普拉格雷的缺陷,为提高药效并降低出血风险,本课题组在氯吡格雷的基础上,通过将7-位甲酯氢进行氘代,在2-位引入酰基形成酯,合成了系列氯吡格雷氘代衍生物。为支持其进一步开发,需要对此类化合物的药代动力学行为进行深入研究。为此,本论文开发了该类化合物在体内的活性代谢物MP-DH4(由于DH4不稳定,对其进行衍生化处理,得到MP-DH4)及与其密切相关的两种非活性代谢物MP-DH3(由于DH3不稳定,对其进行衍生化处理,得到MP-DH3)及DSM3的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的分析方法。为了最大限度地消除样品前处理和仪器分析过程中引入的误差,保证分析方法的准确度与精密度,对于生物样品中目标化合物的测定,ICH-M10和《中华人民共和国药典》(2020版)中《生物样品定量分析方法验证指导原则》要求采用内标法进行定量分析。通常,理想的内标应为同位素内标或待测物结构类似物。以往,开发氯吡格雷代谢产物MP-H3、MP-H4及SM3的LC-MS/MS分析方法时,多以三种代谢产物的三氘代结构为内标。本论文中MP-DH3、MP-DH4及DSM3三种目标待测物本身均为三氘代结构且含有氯原子,氯原子存在高丰度的稳定同位素(~(35)Cl76%,~(37)Cl 24%),导致目标待测物在电喷雾离子源中产生的同位素准分子离子峰[M+1+H]~+、[M+2+H]~+及[M+3+H]~+均有较高丰度,为了保证内标与外标之间的分子量的差别能够达到质谱的分辨率,若选择氘代内标,在待测物的结构基础上则至少需要氘代4个氢原子,但是其合成难度大。若以待测物的非氘代结构作为内标,待测物的非氘代结构中同样含有氯原子,其同位素峰[M+3+H]~+会对外标的[M+H]~+峰产生干扰。那么如何解决上述矛盾与挑战,就成为了本论文内标物设计与合成的关键科学问题。经过研究对比,提出了如下内标物的选择策略与合成方法:氟原子与氯原子同为卤素性质接近,且不存在高丰度的稳定同位素,为此,将待测物非氘代结构中的氯原子换为氟原子,使内标分子量比待测物少19 Da,实现内外标之间在质谱上的区分。通过微小的结构改变保证内标的理化性质与外标接近,实现内标法消除样品前处理与仪器分析过程中引入的误差的目的。本论文以氯吡格雷氘代衍生物CDD01为研究对象,以合成的氟代结构类似物为内标,创新性地建立了在大鼠血浆、比格犬血浆及大鼠组织中同时分析三种代谢产物的精准LC-MS/MS分析方法,对CDD01三种代谢物的血浆药代动力学行为进行了评价,同时首次对噻吩并吡啶类化合物的氘代活性代谢物及相关非活性代谢物的组织分布情况进行了研究。(1)氟代内标物的合成与LC-MS/MS分析方法的建立首次合成了巯基代谢物DH3的体外衍生物MP-DH3的氟代结构类似物F-MP-H3及体内代谢物DSM3的氟代结构类似物F-SM3,并进行了结构Belumosudil IC50表征。再以F-MP-H3作为MP-DH3及MP-DH4共同的内标,以F-SM3作为DSM3的内标,建立了大鼠血浆、比格犬血浆及大鼠组织三种基质中目标代谢产物的LC-MS/MS分析方法。按照ICHGDC-0068使用方法-M10和《中华人民共和国药典》(2020版)中《生物样品定量分析方法验证指导原则》要求进行方法学确证,在大鼠血浆中不存在内外标之间的相互干扰,且内外标提取回收率接近,基质效应接近。另外,三种基质中选择性、精密度及准确度等结果均符合要求。这说明本论文合成的待测物的氟代结构类似物是理想的内标。(2)CDD01代谢物DH3、DH4及DSM3在大鼠血浆中的药代动力学研究大鼠单次灌胃给药CDD01 1 mg/kg、3 mg/kg及10 mg/kg后,血浆中代谢产物DH3的T_(max)均值为0.222 h-0.250 h,DH4的T_(max)均值为0.417 h-0.542 h,DSM3的T_(max)均值为0.375 h-0.458 h,DH3达峰时间最快,DH4与DSM3达峰时间相当。DH3的t_(1/2)均值为0.320 h-0.822 h,DH4的t_(1/2)均值为2.07 h-6.34 h,DSM3的t_(1/2)均值为12.0 h-20.9 h,DH3消除最快,DH4其次,DSM3消除最慢。三个代谢物中DH3的C_(max)与AUC_(0-t)均最小。DH4的C_(max)与DSM3相比较大,而AUC_(0-t)与DSM3相比较小,这与DSM3消除速率慢有关。中剂量和高剂量给药后DH3和DH4的暴露量具有性别差异,雌性的暴露量大于雄性。在给药剂量1-10 mg/kg范围内,活性代谢产物DH4的C_(max)及AUC_(0-t)没有线性动力学特征的趋势。大鼠单次静脉注射给药CDD01 1 mg/kg后,在5 min时即可检测到血浆中DH3、DH4及DSM3三种代谢物的浓度,表明CDmycobacteria pathologyD01可以迅速分布到肝脏或肠道中,进而代谢活化。(3)CDD01代谢物DH3、DH4及DSM3在比格犬血浆中的药代动力学研究比格犬单次口服给药CDD01 0.3 mg/kg、1 mg/kg及3 mg/kg后,血浆中代谢产物DH3的T_(max)均值分别为0.500 h、0.0833 h及0.625 h,DH4的T_(max)均值为0.625 h、0.167 h及0.750 h,DSM3的T_(max)均值为1.00 h、0.375 h及4.38 h,DH3达峰时间最快,DH4其次,DSM3达峰时间最慢。三个代谢物中,DH4的AUC_(0-t)最小,DH3的C_(max)最大。(4)CDD01代谢物DH3、DH4及DSM3的大鼠组织分布研究大鼠单次灌胃给药3 mg/kg CDD01后,对给药后15 min、30 min及6 h的大鼠组织样品进行测定,大鼠给药15 min后DSM3及DH4在所有组织中均有分布,提示DSM3及DH4分布较快。在所有组织中,DSM3在6 h时浓度下降不明显或升高,提示DSM3在这些组织中消除较慢,DH4在6 h时浓度下降明显,提示DH4在这些组织中消除较快。DH3除在小肠、肝脏及肾脏组织中暴露量较大外,其余组织浓度均接近定量下限或低于定量下限,这与DH3本身血浆暴露量低有关。三种化合物在小肠及肝脏中的浓度相比于其他组织较大,这可能与三种化合物在小肠吸收代谢及在肝脏代谢有关。