核酸修复酶包括DNA修复酶和RNA修复酶,是生物体内自发表达的蛋白酶,能够识别并修复由紫外线(ultraviolet,UV)、电离辐射、毒性化学品以及活性氧物种等因素导致的DNA/REntinostat体内NA损伤。核酸修复酶的异常表达与癌症息息相关。低活性的核酸修复酶能够促进癌症发生与发展,而高表达的核酸修复酶能够使癌细胞维持无限增殖能力。因此,核酸修复酶是一种癌症早期筛查中极具代表性的生物标志物。此外,抑制核酸修复酶的活性可以更好地提高对癌症的治疗效果,使其成为癌症治疗的重要靶点。因此,开发针对核酸修复酶活性的检测方法在临床早期诊断,癌症治疗和抗癌药物研发中具有重要意义。本论文将核酸扩增与化学发光和荧光等技术相结合,选择O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O~6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)、脂肪量和肥胖相关的酶(the fat mass and obesity-associated enzyme,FTO)、人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(humanLY2835219 alkyladenine DNA glycosylase,h AAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UDG)为研究模型,发展了一系列生物传感器,实现了对癌细胞或者癌症组织中的核酸检测酶的活性检测。本论文主要内容如下:1.基于在完全等温条件下(37℃)外切酶III(exonuclease III,Exo III)辅助的信号扩增,我们开发了一种简单快速的一步反应的荧光生物传感器,用于灵敏地检测MGMT的活性。封闭的哑铃探针被MGMT去甲基化后,内切酶Pvu II切割哑铃探针,产生带有3’羟基(3’hydroxyl,3-OH)端的发卡探针。随后,EXO III消化发卡探针,产生长的引物DNA,引物DNA能作为长模板,触发EXO III对修饰了BHQ和Cy5的信号探针的循环消化,从而产生明显增强的荧光信号。该方法非常简单、快速(60分钟),具有超高的灵敏度和良好的特异性,可以在单细胞水平上检测MGMT的活性。此外,该方法还可用于MGMT抑制剂的筛选和不同癌细胞中MGMT活性的区分。2.通过整合PARP-1介导的聚合超支化聚(ADP-核糖)(poly(ADP-ribose),PAR)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)-3-(2’-螺旋氨甲烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰苯基)-1,2-二氧杂环丁烷(3-(2’-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3‖-phosphoryloxyphenyl)-1,2-diox etane,AMPDD)化学发光系统,我们构建了一个超灵敏的化学发光生物传感器,用于快速检测人类乳腺组织中的PARP-1。PARP-1被双链DNA(double-stranded DNA,ds D NA)激活后,PARP-1裂解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+),启动生物素(biotin)化ADP-核糖的重复聚合,形成ds DNA-PAR-biotin复合物。随后,ds DNA-PAR-biotin复合物通过Au-S共价键组装到金纳米颗粒(Au nanoparticles,Au NPs)上,从而构建出Au NPs-ds DNA-生物素纳米结构。Au NPs-ds DNA-biotin纳米结构随后捕获链霉亲和素(streptavidin,SA)修饰的ALP以形成Au NPs-ds DNA-ALP纳米结构。离心分离后,Au NPs-ds DNA-ALP纳米结构引发AMPPD的去磷酸化,从而产生极高的化学发光信号。在这个实验中,只有PARP-1被ds DNA激活才能裂解NAD~+,有效地消除了背景信号。冷冻法的引入大大缩短了检测时间。由于PARP-1催化NAD~+裂解的高精度、biotin化ADP-核糖聚合反应的高效率、以及ALP-AMPPD化学发光系统的高信噪比,该生物传感器可以快速灵敏地检测PARP-1,检测限为2.94×10-7 U/μL,准确筛选PARP-1抑制剂,并在单细胞水平上对PARP-1进行量化。最重要的是,该方法可以区分乳腺癌患者组织和健康人组织之间的PARP-1表达,在临床诊断和生物医学研究中具有广阔的应用前景。3.我们开发了一种无荧光团标记的超支链置换扩增方法,用于灵敏检测癌细胞中的FTO活性。当FTO存在时,能够催化N~6-甲基腺嘌呤(N~6-methyladenine,m~6A)修饰的ds DNA底物的去甲基化,从而引发甲基化敏感内切酶Pvu II对ds DNA的裂解,产生带有3-OH末端的ss DNA。带有3-OH的ss DNA被末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,Td T)延长,形成―X-(XXX)_n‖型模板,用于随后的超支链置换扩增。最后,在聚合酶和切口酶的辅助下进行超支化链置换扩增,产生大量的寡核苷酸片段,这些片段可以用核酸染料SYBR Gold染色,产生增强的荧光信号。该检测方法表现出良好的特异性和高灵敏度,对FTO的检测限为9.07×10~(-11) mg/m L(～1.5 f M)。此外,该方法可以有效地筛选FTO抑制剂,并检测单个癌细胞中的FTO活性。4.我们构建了一种用于多重检测癌细胞中h AAG和UDG的去磷酸化介导的化学发光生物传感器。在该生物传感器中,化学发光信号依赖于ALP催化下AMPPD的脱磷酸化。我们设计了一种双功能的ds DNA基底,一个biotin标记的聚-(T)探针,以及两个用于h AAG和UDG的捕获探针。该方法涉及以下4个步骤:(1)DNA糖基化酶诱导双功能ds DNA基底的裂解;(2)Td T识别引物的3-OH末端进行Td T介导的聚合反应;(3)构建Au NPs-ds DNA-ALP纳米结构;(4)ALP引发AMPPD的去磷酸化以产生增强的化学发光信号。通过利用Td T介导的聚合扩增的独特功能和基于ALP-AMPPD的化学发光系统的内在优势,该生物传感器表现出良好的特异性和高灵敏度,对h AAG的检测限为1.53×10~(-6) U/m L,对UDG检测限为1.77×10~(-6) U/m L,并且可以在单细胞水平上量化多种DNA糖基化酶。此外,这种生物传感器还可用于测量动力学参数和筛选DNA糖基化酶抑制剂,在DNA损伤相关的医学研究和疾病诊bacterial infection断方面具有巨大潜力。