白藜芦醇与黄酮类化合物都来源于苯丙烷代谢途径,是一类重要的次生代谢产物,不仅在植物抗逆过程中发挥重要作用,而且具有多种生理活性。白藜芦醇与黄酮类化合物的生物合成不仅涉及多个结构基因的参与,还受到多种转录因子的调控,具有复杂的调控机制。MYB转录因子家族广泛参与调控植物的生长发育、抗逆胁迫、次级代谢产物的积累,对白藜芦醇和黄酮类化合物的合成也具有重要的调控作用。目前,关于植物体内MYB转录因子协调白藜芦醇与黄酮类化合物合成的机制还不清楚。本研究通过对不同发育时期桑椹中MYB基因的表达水平与白藜芦醇和黄酮类化合物含量的分析,发现一个R2R3-MYB转录因子MbMYB306基因的表达量变化与桑椹中白藜芦醇含量变化趋势呈正相关,而与黄酮类化合物含量变化呈负相关。因此,推测该转录因子对白藜芦醇和黄酮类化合物的合成具有一定的调控作用,但其具体的功能和作用机制还不清楚。本文研究了MbMYB306对白藜芦醇与黄酮类化合物合成的调控作用,鉴定了MbMYB306基因的上游调控因子及其互作蛋白质,初步揭示了MbMYB306协调白藜芦醇与黄酮类化合物合成的分子机制。研究结果不仅为白藜芦醇与黄酮类化合物合成机制的研究奠定了基础,同时也为桑树育种提供了基因资源,对于揭示桑树次生物质代谢调控机制具有重要意义。主要研究结果如下:(1)MbMYB306基因的克隆及其编码蛋白的结构特性。通过对不同发育时期桑椹的转录组及白藜芦醇和类黄酮含量变化的联合分析,发现MbMYB306基因的表达量变化与白藜芦醇含量的变化趋势一致,而与类黄酮含量的变化趋势相反。克隆得到了MbMYB306基因,其编码的蛋白质包含349个氨基酸,N端含有保守的R2和R3结构域,R3结构中包含有一个b HLH结合结构域。(2)MbMYB306基因的表达特性及MbMYB306蛋白的亚细胞定位。MbMYB306基因在叶中表达量相对较高,茎和根中相对较低。MbMYB306的启动子(p MbMYB306)包含有多种激素和光响应元件等,p MbMYB306具有ABA、GA、Me JA、光照诱导表达活性。MbMYB306定位于细胞核内。(3)MbMYB306基因促进白藜芦醇合成,抑制类黄酮的合成。MbMYB306基因在桑树叶片中瞬时表达,以及在毛状根中过表达都可促进转基因组织中白藜芦醇的积累,而抑制类黄酮的合成。MbMYB306可以促进苯丙烷途径上游的Mb4CL基因和白藜芦醇合成分获悉更多支途径中的MbSTS7基因的表达,但能抑制类黄酮合成分支途径的MbCHS、MbF3H、MbDFR、MbANS等结构基因的表达。酵母单杂交实验证明MbMYB306能够与MbSTS7基因启动子结合,能够显著增强MbSTS7基因启动子的转录活性,而抑制MbCHS、MbF3H、MbDFR和MbANS基因启动子的转录活性。(4)MbMYB306基因增强桑树的抗病性。灰霉菌侵染可以诱导MbMYB306和MbSTS7基因的表达。桑树叶片瞬时过表达MbMYB306或MbSTS7基因都可以显著增强受灰霉菌侵染叶片的过氧化物酶和过氧化氢酶活性,减少叶片中活性氧的积累,增强对灰霉菌的抗性。(5)调控MbMYB306基因表达的转录因子及MbMYInfectious hematopoietic necrosis virusB306相互作用蛋白的鉴定。通过酵母单杂交实验发现MbbZIP60能够直接与MbMYB306的启动子结合,荧光素酶报告基因实验和GUS活性检测实验结果CP-456773供应商表明MbbZIP60能够抑制MbMYB306启动子的转录活性;MbbZIP60基因在桑树叶片中瞬时超表达能抑制MbMYB306和MbSTS7基因的表达,促进MbDFR,MbCHS和MbANS基因的表达。荧光素酶互补实验证明MbMYB306与MbWRKY49之间存在相互作用。MbWRKY49基因在桑树叶片中瞬时超表达能够促进MbMYB306和MbSTS7基因的表达。