栀子提取物改善胆汁淤积性肝损伤的作用机制研究

目的:胆汁淤积是胆汁淤积性肝病(CLD)的主要表现,CLD有发展为终末期肝病的风险。栀子具有清肝利胆的功效,常用于治疗肝胆湿热。研究表明,栀子提取物(栀子总环烯醚萜苷提取物)可改善胆汁淤积性肝损伤,但其潜在机制尚不清楚。因此,本研究采用α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)诱导急、慢性胆汁淤积性肝损伤模型,研究栀子提取物(GE)改善急、慢性胆汁淤积性肝损伤的药效作用,通过胆汁酸靶向代谢组学和肝脏转录组学等,阐明GE治疗急、慢性胆汁淤积性肝损伤的作用机制,为栀子的临床应用及新药研发提供科学依据。方法:1.UPLC-MS/MS法同时定量分析生物样本中31种胆汁酸的方法学研究本研究采用UPLC-MS/MS定量分析系统,建立同时定量分析胆汁酸(BAs)肝肠循环9个部位的生物样本中31种BAs的分析方法。方法学验证包括选择性、残留、定量下限(LLoQ)、标准曲线、准确度、精密度、基质效应、稳定性和回收率等。2.栀子提取物对急性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究SPF级雄性SD大鼠40只,随机分为5组:对照组、模型组、奥贝胆酸组(OCA)、GE低剂量组(GE-L)和GE高剂量组(GE-H),每组8只。OCA、GE-L和GE-H组的大鼠分别灌胃给予OCA(2mg·kg-1)、GE(21mg·kg-1和42mg·kg-1),每天一次,连续5天。对照组和模型组给予等体积饮用水(10mL·kg-1)。第3天给药1小时后,对照组给予葵花籽油(5mL·kg-1),其余各组灌胃ANIT(40mg·kg-1)造模。末次给药前禁食12h,收集尿液和粪便。末次给药1h后,1%戊巴比妥钠麻醉大鼠。腹主动脉取血,离心(3000rpm,15min,4℃)分离血清。摘取肝脏,收集十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物用于BAs检测;取部分肝脏、回肠、结肠组织用于qRT-PCR,-80℃冰箱保存备用;部分肝脏用福尔马林固定,用于病理观察。采用血清生化分析仪检测血清生化指标(ALP、GGT、TBA、TBIL和DBIL)。采用HE染色观察肝组织病理损伤情况。采用UPLC-MS/MS定量分析血清、肝脏、尿液、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和粪便中的BAs水平。采用Illumina BeadChips ArrayTM进行肝脏转录组测序(RNA-seq)分析(n=3,对照组/模型组/OCA组/GE-H),并用qRT-PCR方法对RNA-seq结果进行验证。3.栀子提取物对慢性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究SPF级雄性SD大鼠65只,随机分为6组:对照组、模型组、奥贝胆酸组(OCA)、茵栀黄组(YZH)、GE低剂量组(GE-L)和GE高剂量组(GE-H),每组10～11只。除对照组外,其余各组大鼠每周3次灌胃ANIT(40mg·kg-1)造模。从第3w开始,OCA、YZH、GE-L和GE-H组的大鼠分别灌胃给予OCA(2mg·kg-1)、YZH(6.35mL·kg-1)、GE(21mg·kg-1 和 42mg·kg-1),对照组和模型组给予等体积饮用水(10mL·kg-1),每天给药1次,于给药后4w、6w分批取材。血清生化指标、病理检查以及BAs检测方法同上。取第二批取材时的肝组织,采用10x Genomics ChromiumTM进行单细胞转录组测序(snRNA-seq)分析(n=3,对照组/模型组/GE-H组),并用qRT-PCR方法对snRNA-seq结果进行验证。结果:1.UPLC-MS/MS法同时定量分析生物样本中31种胆汁酸的方法学研究基于UPLC-MS/MS成功建立了高通量、灵敏的BAs靶向代谢组学分析方法,可同时定量测定血清、肝脏、尿液、肠道内容物(十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)和粪便等9类生物样本中31种BAs。所建立的方法其选择性、残留、定量下限Adezmapimod(LLoQ)、标准曲线、准确度、精密度、基质效应、稳定性和回收率等结果均符合2020版《中国药典》设定的生物样品测定要求。所建立的BAs分析方法解决了 BAs测定中性质相似及构象异构体的分离,且峰形互不干扰,分离效果较好。2.栀子提取物对急性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究(1)栀子提取物对ANIT致急性胆汁淤积性肝损伤的药效学研究与对照组相比,模型组大鼠血清TBA、TBIL、DBIL、ALP和GGT水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比,GE-H组血清TBA、TBIL和DBIL浓度显著降低(P<0.05),而OCA和GE-L组仅表现出降低趋势。GE-H组的ALP浓度表现出明显的降低趋势,且降幅大于OCA组。组织形态学显示,与对照组相比,模型组肝组织有明显的胆管增生(7/8大鼠评分≥3)、门管区可见炎性细胞浸润(5/8大鼠评分≥3)。与模型组相比,GE-L和GE-H组的胆管增生和炎性细胞浸润程度明显减轻,尤其是GE-H对胆管增生的改善作用更明显,GE-H组2/8大鼠肝脏形态学基本正常。OCA组的改善效果与GE-H组相似。血清生化和肝组织病理结果表明,GE可剂量依赖性明显改善ANIT诱导的急性胆汁淤积性肝损伤。(2)栀子提取物改善急性胆汁淤积性肝损伤的作用机制模型组胆汁酸肝肠循环各部位的总胆酸(TBA)、初级胆汁酸(PBA)、次级胆汁酸(SBA)、游离型胆汁酸(UnconBA)、结合型胆汁酸(ConBA)、牛磺结合型胆汁酸(TaurineBA)和甘氨结合型胆汁酸(GlycineBA)的含量和比例发生明显变化,尤其是肝脏、血清、尿液和粪便中TaurineBA及PBA的变化最明显。与对照组比较,模型组肝脏、血清和尿液中的TBA、PBA和TaurineBA水平显著升高(p<0.01),其中TaurineBA的比例分别增高55.98%→94.99%、17.13%→88.87%、8.87%→77.51%;粪便中 TBA 和 PBA 水平显著降低(p<0.01)。与模型组比较,GE-H组和OCA组肝脏中TBA、PBA和TaurineBA水平明显降低;GE-H组血清和尿液中TBA、PBA和TaurineBA显著降低;GE-H组粪便中TBA和PBA显著升高(p<0.05)。采用单元分析(p<0.05)和多元分析(VIP>1)统计的显著性来识别对照组和模型组之间的差异性胆汁酸。Tβ-MCA、TCA和GCA是大鼠肝脏中的差异性胆汁酸,血清和尿液中的差异性胆汁酸与肝脏基本相似,而粪便中的差异性胆汁酸是β-MCA和DCA。与对照组相比,模型组肝脏、血清和尿液中的TCA和Tβ-MCA水平显著升高,粪便中β-MCA和DCA显著降低(p<0.05)。与模型组相比,GE-H组血清和尿液中TCA显著降低,粪便中β-MCA和DCA显著升高(P<0.05)。肝脏RNA-seq的差异表达基因(DEGs)及KEGG通路富集分析结果显示,模型组、GE-H和OCA组的DEGs显著富集于PBA生物合成和胆汁分泌通路。与模型组相比,GE和OCA给药处理后,参与PBA生物合成和胆汁分泌的部分基因(如Cyp8b1、Cyp27a1、Fxr、Oatp1、Ntcp和Ugt1a1等)表达上调。采用qRT-PCR对RNA-seq结果进行验证,与对照组相比,模型组肝脏中Cyp8b1、Fxr、Shp、Oatp1和Ntcp mRNA表达显著下调(p<0.001);与模型组相比,GE-H组Cyp8b1、Fxr和Oatp1 mRNA的表达显著上调(p<0.05)。BAs定量、RNAseq及qRT-PCR验证结果表明,GE主要通过上调Cyp8b1 mRNA表达来抑制肝脏中PBA生物合成,从而降低肝脏BAs水平;上调Fxr和Oatp1mRNA表达,促进BAs经肝-肠-粪便途径排泄,并抑制肝脏中PBA经替代途径进入血液,降低血清BAs水平,从而减轻肝脏胆汁淤积,改善BAs肝肠循环紊乱。3.栀子提取物对慢性胆汁淤积性肝损伤的改善作用及机制研究(1)栀子提取物对ANIT致慢性胆汁淤积性肝损伤的药效学研究经每周3次给予40mg·kg-1 ANIT反复刺激,6w和8w生化和肝脏病理检查,证明慢性胆汁淤积性肝损伤模型造模成功,模型组表现为TBIL、DBIL、ALP、GGT等水平持续升高(p<0.05),肝脏病理显示有明显胆管增生、胆管及其周围炎性细胞浸润,片状纤维化。GE给药后4w、6w血清中TBIL、DBIL、ALP和GGT均较模型组未见统计学显著性差异。由于栀子苷反复较长时间给药可在体内形成灰蓝色色素类物质,可能干扰以上指标的测定,这可能是生化指标未见显著变化的原因。因此,本研究以病理的改善为直接依据。对照组大鼠肝细胞形态未见明显异常,细胞排列整齐,肝索肝窦分界明显,在门管区偶见轻微的炎性细胞浸润,未见胆管增生等病理改变。造模6w和8w,均可见肝组织中胆管增生明显,呈弥漫性,并延伸进入肝小叶中,增生的胆管周围可见明显的炎性细胞浸润,随时间延长病变加重。GE-L组给药4w后病理损伤未见明显改善,但是延长给药时间至6w后可见胆管增生程度明显减轻,病变范围减小,呈局灶性;GE-H组给药4w和6w可明显改善胆管增生,缩小病变范围。YZH组的改善效果与GE-H组相似。马松染色结果与HE染色结果基本一致。上述结果表明,GE对慢性胆汁淤积性肝损伤病理具有明显的改善作用。(2)栀子提取物改善慢性胆汁淤积性肝损伤的作用机制造模6w后,模型组大鼠肝脏和血清中ConBA、TaurineBA、PBA、TBA和UnconBA水平显著升高(p<0.05),其余类型胆汁酸有升高趋势;十二指肠中SBA显著降低(p<0.05)。给予GE、OCA、YZH治疗4w(造模6w)后,与模型组相比,肝脏和血清中的胆汁酸水平未见明显改变,但十二指肠中各类型胆汁酸水平呈升高趋势。造模8w后,模型组大鼠肝脏中PBA显著升高,肝脏和血清中ConBA、GlycineBA和TaurineBA显著升高(P<0.05)。与模型组相比,GE、OCA、YZH组肝脏和血清中各类型胆汁酸水平有降低趋势,且GE-H组降低趋势较GE-L组明显。造模8w时,对照组和模型组肝脏中的差异胆汁酸是Tβ-MCA、TCA、TCDCA和GCA,血清中的差异性胆汁酸与肝脏基本相似。与对照组相比,模型组血清中Tβ-MCA、TCA、TCDCA和GCA水平显著升高(p<0.01);同时期GE和OCA组血清中Tβ-MCA、TCA、TCDCA和GCA水平明显降低,其中GE-H组的TCDCA的水平显著降低(p<0.01)。通过肝组织单核转录组测序(snRNA-seq)分析,进一步阐释GE通过影响BAs代谢、胆管细胞增殖而改善慢性胆汁淤积性肝病的作用机制。肝脏DEGs的KEGG通路富集分析结果表明,GE-H组与药效相关的基因显著富集(padj<0.05)于PBA生物合成和胆汁分泌通路,与模型组相比,GE处理后可使参与PBA生物合成和胆汁分泌通路的多种基因(如Cyp8b1、Cyp2 7a1、Fxr、Shp、Mrp2、Bsep、Ntcp、Oatp1和Asbt等)表达上调,部分基因(如Cyp 7a1、Slc27a5和Baat等)表达下调。采用qRT-PCR对snRNA-seq的结果进行验证,与对照组相比,模型组中Cyp7a1和Mrp3 mRNA表达显著上调,Sult2a1和Oatp1 mRNA显著下调(p<0.05)。而给予GE、茵栀黄后,大鼠肝脏中Cyp 7a1和BacsmRNA的表达明显下调、Ostα mRNA显著下调(p<0.05)。综上所述,GE可能主要通过抑制BAs合成限速酶Cyp7a1 mRNA的表达来影响肝脏中PBA的合成,并调控参与BAs转运相关的多种转运体,促进BAs的排泄,降低血清和肝脏中胆汁酸水平,从而改善慢性胆汁蓄积性肝损伤大鼠的BAs代谢,减轻胆汁淤积所造成的肝脏损伤。依据seurat聚类结果进行分析,通过差异表达marker基因(differentially expressed marker genes)进行肝脏细胞定义,对照组、模型组和GE-H组的肝脏细胞都定义出8种细胞簇:肝细胞(Hepatocytes)、枯否细胞(Kuffer cells)、肝星状细胞(Hepatic stellate)、内皮细胞(Endothelials)、炎性巨噬细胞/单核细胞(Inflammatory macrophages/monocyte)、yδ T 细胞(yδ T cells)、成熟 B细胞(Mature B cells)和胆管细胞(Cholangiocytes)。与对照组相比,模型组的胆管细胞数量明显增多(对照组vs模型组:0.05%vs 14.90%),而肝细胞数量明显减少(66.90%vs 50%)。给予GE-H治疗后,胆管细胞数量明显减少(GE-H组vs模型组:9.40%vs 14.90%),而肝细胞数量轻度增加(55.50%vs 50%)。随后对胆管细胞进行进一步亚群分类,共定义出3种细胞簇:胆管样细胞(cholangiocyte-like)、肝样细胞(hepatocyte-like)和肝祖细胞。与对照组比较,模型组中肝祖细胞和肝样细胞数量明显增多;而GE-H组肝祖细胞和肝样细胞数量均明显减少。提示部分胆管细胞可能是由肝细胞分化而来的,而GE可通过抑制这一分化作用,减少胆管细胞增生。为了验证这一结论,对肝细胞和胆管细胞进行了拟时(pseudotime)分析,结果显示对照组的肝细胞和胆管细胞处于2种不同的状态,模型组的部分肝细胞出现在胆管细胞处于的状态,表明肝脏长期胆汁淤积后部分肝细胞分化为胆管细胞。GE-H组的两种细胞所处状态与模型组类似,但处于胆管细胞状态的肝细胞数量较模型组少。肝细胞转化而来的胆管细胞属于肝胆双表型细胞,既具有肝脏细胞的胆汁合成与分泌特性,又具有胆管细胞易感炎性刺激而激活增殖的特性,在慢性胆汁淤积性肝损伤病情发展中起重要作用。综上所述,GE可能通过抑制肝细胞分化为胆管细胞,抑制肝胆双表型细胞增生和异常的胆汁分泌,从而减轻胆管增生和炎症,减轻慢性肝损伤的进展。结论:1.GE对急、慢性胆汁淤积性肝损伤具有改善作用,该作用可能与减轻肝脏损伤和炎性浸润,抑制胆管和纤维组织增生,进而改善大鼠体内胆汁酸稳态有关。2.GE改善急性胆汁淤积性肝损伤的作用机制可能与上调Cyp8b1 mRNA的表达,抑制肝脏中PBA(尤其是TCA和Tβ-MCA)合成,并且上调核受体Fxr和转运体Oatp1 mRNA表达,促进肝脏中PBA经肝-肠-粪便途径排出体外,抑制肝脏中PBA经替代途径进入血液,降低肝脏和血清中BAs水平而产生抗急性胆汁淤积肝损伤的作用。3.GE可能一方面通过抑制肝细胞分化overwhelming post-splenectomy infection为胆管细胞,抑制肝胆双表型细胞增生和异常的胆汁分泌,从而减轻胆管增生和炎症,减轻慢性肝损伤的进展;另一方面通过抑制BAs合成限速酶Cyp7a1 mRNA的表达,抑制肝脏中PBA(尤其是TCDCA、GCA、Tβ-MCA和TCA)的合成,并调控参与BAs分泌相关的核受体和多种转运体的表达,抑制肝脏PBA进入血液,促进BAs经肝-肠-粪便途径排泄,降低肝脏和血清中BAs的水平而产生抗慢性胆汁淤积性肝损伤的作用。4.本研究所建立的BAs分析方法可同时定量分析BAs肝肠循环各部位胆汁酸水平,评估药物对BAs肝肠循环的影响。血清中的差异性胆汁酸TCA、Tβ-MCA和GCA,不仅可以作为诊断胆汁淤积性肝损伤的生物标志物,还可以判断药物是SBE-β-CD使用方法否产生肝保护作用。