研究目的:提高骨骼肌氧化代谢能力可以预防各种代谢类疾病,如胰岛素抵抗和2型糖尿病。骨骼肌是哺乳动物体内含量最多的组织,由不同类型的肌纤维混合而成,根据肌球蛋白重链分为慢肌球蛋白(MyHCⅠ)和快肌球蛋白(MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx)。不同类型的肌纤维均具有高度的可塑性,有研究表明,通过增加Ⅰ型肌纤维的比例可以提高运动耐力、抗机体疲劳和预防代谢疾病等。柚皮素是一种广泛存在于芸香科植物中的二氢黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗代谢紊乱、抗纤维化、降血糖、降血脂等多种药理活性。在医药学领域有广泛的关注,近来已经报道柚皮素在改善肌肉健康方面具有有益效果,能够促进肌细胞的摄糖能力,但是尚未探索柚皮素调节骨骼肌氧化代谢能力的作用和机制。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α),在氧化能力强的组织中高表达,如骨骼肌和心肌,通过提高脂肪酸氧化和控制线粒体质量关键成分促进线粒体生物发生和调控氧化代谢,是线粒体能量代谢的关键调节因子。另外PGC-1α优先在富含Ⅰ型肌纤维的肌肉组织中表达,且在调控肌纤维类型转化过程中发挥重要作用。运动能够显著提高骨骼肌氧化代谢能力,缓解机体疲劳和代谢相关疾病,由于社会当中存在运动障碍和运动耐受能力差的人群,身体不足以支持运动,因此希望通过营养补充代替运动的方式弥补运动不足的情况。综上所述,本研究以C57BL/6J小鼠为研究对象,建立两组不同剂量柚皮素处理组模型,通过运动能力测试及分子水平检测,探究柚皮素对骨骼肌氧化代谢能力的影响。研究方法:(1)动物分组及营养素干预:选用雄性8周龄C57BL/6J小鼠30只,在SPF级动物房适应一周后,将实验小鼠随机平均分为对照组(CON)、50 mg/kg体重柚皮素处理组(NE50)和100 mg/kg体重柚皮素处理组(NNeuroscience EquipmentE100)。分组完成后每天给柚皮素处理组小鼠(NE50、NE100)灌服不同剂量的柚皮素溶液,对照组小鼠灌服同等体积的羧甲基纤维素钠溶液,Erastin纯度灌胃时间为12周。灌胃期间每三天记录一次小鼠食物摄入量,每周记录一次小鼠体重变化。(2)代谢率及体成分检测:使用Columbus CLAMS实验动物监测系统实时监测并记录小鼠摄氧量(VO2)、二氧化碳排出量(VCO2)及呼吸代谢率(RER),使用QMR06-06OH小型动物体成分分析仪检测实验小鼠瘦肉含量和脂肪含量。(3)运动能力测试:使用小鼠握力测定仪测试小鼠前肢抓力;小鼠跑步机测试低速跑和高速跑运动时间,小鼠跑步测试前两周进行低速适应性训练;使用钢丝悬吊测试前肢悬挂时间。(4)实时荧光定量(Real-time qPCR):所有运动测试结束两天后取材,使用戊巴比妥钠麻醉小鼠,取各组小鼠腓肠肌和比目鱼肌,从转录水平检测肌肉组织中肌球蛋白重链基因亚型MyHCⅠ、MyHCⅡa及肌红蛋白、TNNT1和PGC-1α的表达。(5)蛋白质免疫印迹(Western Blot):从翻译水平检测腓肠肌和比目鱼肌中肌球蛋白重链7(MyHCⅠ)、肌球蛋白重链2(MyHCⅡa)及PGC-1α的表达。(6)免疫荧光(Immunofluorescence):通过荧光染色,分析各组腓肠肌氧化型肌纤维数量分布情况。(7)酶活性检测:检测骨骼肌中氧化酶SDH(琥珀酸脱氢酶)和糖酵解限速酶HK(己糖激酶)的活性。(8)数据分析:数据通过SPSS 21.0和Gra PhPad Prism 8进行统计分析及文章作图,两组间比较采用独立样本T检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05时差异被认为有统计学意义。研究结果:(1)柚皮素显著提高小鼠耐力运动表现。经运动能力测试后显示柚皮素处理组小鼠与对照组小鼠相比,前肢悬吊时间和低速跑力竭时间显著增加(NE50,P<0.05;NE100,P<0.01),而运动爆发力相关的前肢抓力和高速跑测试未见明显变化。(2)柚皮素增强小鼠的氧化代谢能力。柚皮素处理组小鼠(NE100)与对照组小鼠相比,夜间呼吸交换率(RER)显著降低(P<0.01),摄氧量(VO2)明显增加(P<0.05);柚皮素处理组小鼠(NE100)腓肠肌中SDH和HK酶活性显著增加(P<0.01),表明柚皮素处理可以提高骨骼肌中氧化代谢酶活性。(3)柚皮素促进小鼠氧化型肌纤维mRNA和蛋白表达。q-PCR结果显示,与对照组相比,柚皮素处理组显著上调慢肌相关基因MyHCⅠ、TNNT1(NE50,P<0.05;NE100,P<0.01),MyHC IIa(NE100,P<0.05)和肌红蛋白(NE100,P<0.01)的表达;蛋白质免疫印迹结果显示,柚皮素显著激活肌球蛋白重链MyHC I和MyHCⅡa蛋白表达(MyHC I:NE50,P<0.05;NE100,P<0.01。Mselleck激酶抑制剂yHC IIa:NE100,P<0.05);免疫荧光染色结果显示,NE100组小鼠肌肉中氧化型肌纤维数量较对照组增加明显(P<0.01)。(4)柚皮素显著上调小鼠骨骼肌PGC-1α表达水平。通过蛋白质免疫印迹和实时荧光定量实验结果显示,与对照组相比,经柚皮素处理后小鼠肌肉组织中PGC-1α显著增加(NE50,P<0.05;NE100,P<0.01)。研究结论:柚皮素可以增强小鼠耐力运动能力,提高氧化酶活性及摄氧量,显著提高PGC-1α在骨骼肌中的表达。因此柚皮素补充可能在调节骨骼肌氧化型肌纤维含量和提高氧化代谢能力中起到重要作用。