柑橘(Citrus sinensis,L.Osbeck)是一种风味独特,富含多种人体所需营养物质的水果,食用方式主要是鲜食。柑橘采摘后极易遭受真菌侵染造成巨大的经济损失。指状青霉(Penicillium digitatum,P.digitatum)导致的绿霉病是柑橘各类真菌病害中最主要的一种。柑橘绿霉病的防控以使用化学杀菌剂为主,但杀菌剂的使用不仅污染环境、存有安全性隐患,而且会使果实本身产生耐药性,影响病害防控效果。通过外源激发子诱导果实抗病性来提升果实抗病能力是一种绿色安全的病害防控方法。在果实上接种外源激发子后,多种信号分子和代谢途径发生变化,其中许多抗病关键基因积极调控抗病功能,其编码的酶也发挥重要的作用。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine aminolyase,PAL)是苯丙烷代谢第一步催化反应的关键限速酶,控制着该途径中的碳通量,与多种具有抗逆功能的次生代谢产物合成相关。已有研究发现果实上的PAL积极响应多种激发子的处理,与抗病过程密切相关。但是具体果实中PAL基因的鉴定及其参与调控果实采后病害的功能和相关机理的研究目前还很缺乏。因此,本研究对柑橘PAL基因家族成员进行了鉴定和生物信息学分析,探究了具体CsPALs对柑橘绿霉病的调控作用和CsPALs调控苯丙烷途径与初生代谢的相关机制。主要研究内容及研究结果如下:(1)从柑橘的全基因组中鉴定到了4个PAL基因家族成员,将其命名为CsPAL1-CsPAL4。通过理化性质、基因结构、蛋白结构、蛋白序列及系统进化关系分析发现:4个CsPALs的编码序列在2100 bp左右,蛋白约有720个氨基酸,分子大小约为7800 Da,都是更多酸性、具有亲水性的稳定蛋白;蛋白的三级结构都类似“海马状”;CsPALs基因和蛋白的结构十分保守,CsPALs蛋白序列中都含有完整的三联体酶活性中心,暗示它们都具有催化活性;CsPAL1、CsPAL2、CsPAL4与拟南芥中的At PALs相似度高。(2)在柑橘果实上接种盔形毕赤酵母(Pichia galeiformis,P.galeiformis)、壳寡糖(Oligochitosan,COS)和水杨酸(Salicylic acid,SA)都能够诱导果实的抗病性。通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)测定柑橘上4个CsPALs的表达量发现外源激发子处理果实后,4个CsPALs的表达量在不同的时间点显著上调,表明CsPALs积极响应抗病反应,可能具有调控绿霉病抗病性的功能。(3)亚细胞定位试验表明4个CsPALs蛋白都定位于细胞质中。分别在柑橘果实上瞬时过表达4个CsPALs并接种P.digitatum后,瞬时过表达CsPABioactive materialLs组柑橘果实的发病率和病斑直径显著低于对照组,其中CsPAL1和CsPAL3瞬时过表达诱导柑橘果实绿霉病抗病性的效果强于CsPAL2和CsPAL4。(4)对瞬时过表达CsPALs后的柑橘果实样品进行转录组测序。Gene Ontology(GO)注释发现四个过表达CsPALs组生物学过程(Biological process,BP)中注释到较多的都是细胞过程(Cellular process)、代谢过程(Metabolic process)和生物调节(Biological regulation)基因,在细胞组成(Cellular component,CC)中较多的都是细胞部分(Cell part)和膜部分(Membrane part)基因,在分子功能(Molecular function,MF)中较多的都是催化活性(Catalytic activity)基因。KEGG分析表明过表达CsPALs组果实中的苯丙烷代谢途径(Phenylpropanoid biosynthesis)都显著富集,其中与木质素合成相关基因儿茶酚-O-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)和肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因的表达水平显著下调,与类黄酮生物合成相关基因查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)基因的表达水平显著上调。另外,瞬时过表达组果实中糖代谢和莽草酸途径部分基因也都显著上调表达。(5)进一步通过实时荧光定量PCR、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和氨基酸自动分析仪等方式测定了各组果实中的相关基因表达量,糖、酸和氨基酸等物质含量。结果发现,CsPALs在柑橘果实上瞬时过表达后,苯丙烷代谢上游的肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)活性显著增强,木质素合成相关基因(COMT和CAD)表达水平和木质素含量下降。相反,黄酮类合成相关基因CHS和查尔酮异构酶(Chalcone isomerase genes,CHI)基因的表达水平和类黄酮、总酚含量上升。蔗糖的合成和分解代谢、葡萄糖代谢被激活,途径中重要的基因表达量和酶活性增强,各种糖和酸的含量发生不同程度的变化。莽草酸途径中重要基因更多也显著上调表达,促进了各类游离氨基酸的积累。综上所述,本研究从柑橘基因组中鉴定到了4个CsPALs,成员之间较为保守,都积极响应外源激发子的处理,且具有提高柑橘果实绿霉病抗病性的功能,具体的调控机制包括:促进苯丙烷代谢途径中类黄酮和总酚的合成而并非木质素的合成;激活蔗糖和葡萄糖代谢途径,不同程度改变糖和酸的含量;激活莽草酸途径,促使各类游离氨基酸积累。本研究从分子生物学角度开展了CsPALs基因功能的研究,丰富了非模式植物上PAL参与调控抗病性的分子机制,为外源处理提高柑橘抗病性提供了科学依据,也为从新角度解决柑橘采后病害问题奠定了理论基础。