目的终末期肝病(end-stage liver diseases,ESLDs)是一种以肝功能异常及全身表现为特点的临床综合征,急性肝衰竭与慢性肝病均可导致终末期肝病。据世界卫生组织统计,全球每年因终末期肝病死亡者约300万。我国作为乙肝大国,其中20%~30%的患者将发展为终末期肝病。终末期肝病已经成为一个高发病率、高死亡率的全球性公共卫生问题,是危害国民健康和经济负担的重大疾病之一。原位肝移植是Alisertib价格目前临床治疗肝衰竭最有效的方案,然而供体肝脏来源短缺使得只有很少患者可能得到肝移植治疗,甚至许多患者在等待肝源的过程中死亡。其他问题还包括移植后出现排斥、手术风险大及手术成本高等,这些缺点很大程度上限制其在临床上终末期肝病治疗的应用和推广。近几年,再生医学的研究开展迅速,细胞移植,尤其是肝细胞移植已经在终末期肝病的治疗中取得了一定的效果。然而,由于肝细胞体外难以扩增的特点,所以同样无法解决供体受限的瓶颈。越来越多的研究开始关注干细胞在肝病治疗中的应用。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞类型。目前,通过干细胞移植治疗肝衰竭的基础研究取得了令人可喜的进展。筛选和确定可以用在疾病治疗的干细胞类型,是开展基于干细胞的治疗终末期肝病的基础。目前可供移植治疗终末期肝病的干细胞包括:多能干细胞即人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,ESCs)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs),和成体干细胞,包括胆管树干细胞(biliary tree stem cells,BTSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)等。BTSCs是治疗ESLDs的理想候选细胞。并且BTSCs具有向成熟肝细胞、胆管上皮细胞或功能性胰岛分化的潜能,是一类存在于胆道树管壁上的胆周腺体内的干细胞。与成熟肝细胞相比,BTSCs具有体外增殖能力,和具有组织获取来源广泛等优点;研究发现通过将胎儿来源的BTSCs移植到患者体内,3个月后患者术后MELD评分下降、肝功能改善,并且不需要持续的免疫抑制治疗。与ESCs等多能干细胞相比,BTSCs具有应用安全性,且可实现向功能性细胞的高效诱导分化成熟的能力;比脐带MSCs相比,BTSCs移植后可定植入受体肝脏,在体内分化成熟,发挥组织功能性修复和替代的功能。这些基础和应用研究都证明了BTSCs是一类具有低免疫原性、可在体内和体外分化成为功能性的肝细胞的干细胞类型。然而,BTSCs是成体干细胞,在供体组织中数量有限。前期研究中,无血清(Kubota`s Medium,KM)培养基可获得纯化的原代BTSCs,呈克隆样生长,但该体系下未能实现BTSCs的传代扩增。因此,BTSCs开展临床应用过程中存在的细胞数量有限问题亟需解决。建立良好的体外扩增体系被认为是维持细胞干性和细胞正常生理功能的关键。目前BTSCs的培养和扩增还主要借鉴早期已经建立的内胚层器官干细胞(如肠干细胞、肝干细胞等)的体外扩增方案,主要有共培养和Matrigel培养两种体系。由于共培养体系操作的繁琐复杂及饲养层制备过程可能出现污染等问题,基于水凝胶的三维培养方法逐渐变成了实现内胚层器官来源的上皮干细胞体外扩增的首选方法案。目前的水凝胶的三维体系主要基于Matrigel基底胶,是从小鼠软骨肉瘤中提取的基质成分。Matrigel基底胶的主要成分包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、硫酸肝素糖蛋白、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)等。通过在Matrigel基底胶基础上添加多种生长因子的方法已经被证实可用于多种内胚层干细胞的长期培养扩增中。Huch M等人使用Matrigel基底胶体系在体外对肝干细胞进行培养并克隆为类器官,此种条件下培养的时间可长达数月之久,实现肝干细胞的长期培养。小分子化合物是内胚层干细胞体外扩增发挥的作用的关键成分。小分子化合物是分子量小于500道尔顿的单体物质,在i PSCs相关研究中已被证实可有效提高体细胞重编程的效率。Wang等人利用小分子化合物(转化生长因子-超家族I型激活素受体样激酶受体ALK4、ALK5和ALK7的抑制剂SB431542、非ATP竞争性MEK抑制剂PD0325901、G9a样蛋白和G9a组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂Bix01294、DNA甲基转移酶的非核苷抑制剂RG108、钙离子通道抑制剂Bay K8644等)实现了将消化道上皮细胞重编程获得类似定型内胚层的诱导内胚层干/祖细胞,并在该体系下实现对该内胚层干细胞长期传代扩增。这种基于小分子化合物替代生长因子的方式,极大的增加了干细胞扩增过程中的安全性,也同时有效降低了干细胞扩增所需的成本。因此,通过构建Matrigel基底胶和小分子化合物组合的体系,可为BTSCs的体外扩增提供可行方案。针对BTSCs临床应用数量MRTX849体外有限的问题,我们考虑对原KM培养基进行优化并构建体外传代扩增体系——粘多糖胶Glycogel体系,通过筛选促进BTSCs扩增的细胞因子和小分子化合物组分构成改良扩增培养基p KM,并且额外添加细胞外基质成分以实现BTSCs的传代扩增。本Glycogel体系中骨架基质是化学限定的,例如胶原蛋白或致密的胶原蛋白水凝胶;或非化学限定的,例如复合蛋白水凝胶。适合的复合蛋白水凝胶包含细胞外基质组分,如层粘连蛋白、胶原蛋白IV、透明质酸、硫酸肝素蛋白聚糖。这里我们使用2种:一种是可铺板、包埋的A骨架基质:来自小鼠肉瘤细胞的细胞外基质蛋白质的水凝胶。其可从商业来源获得,如Matrigel(Corning)。另一种是自制的添加到培养基中的B骨架基质,由适当比例的透明质酸(HA)和硫酸乙酰肝素(HS)混合使用的HAHS水凝胶。在本课题组前期的研究基础上,我们建立了一种基于粘多糖胶Glycogel的BTSCs培养体系。此体系提供的BTSCs扩增方法,不仅能够为BTSCs提供稳定的3D微环境,还增加了细胞扩增空间,减少外界刺激对干细胞的不良影响;在保证细胞大量扩增的同时,维持胆管树干细胞的干性,实现为h BTSCs治疗终末期肝病提供充足数量且功能稳定的种子细胞。同时,该体系的建立也可为其他干细胞来源肝细胞临床应用提供参考实验方案,最终实现细胞移植治疗肝病的突破性进展。方法1、根据人BTSCs的实验方法,对小鼠肝外胆管组织进行分离消化,使用KM培养基进行培养,确定小鼠BTSCs的细胞属性,为小鼠BTSCs的体外扩增体系提供金标准。并且通过转录组测序分析小鼠BTSCs与人BTSCs的相似性。2、查阅相关研究并结合实验室前期研究结果,筛选得到促进BTSCs扩增的细胞因子和小分子化合物的Glycogel组分以进行构建扩增培养基。观察更换培养基后细胞的生长状态。通过q PCR、免疫组化、流式分析、等实验技术比较,验证扩增培养基的效果,同时鉴定是否在该体系快速扩增时仍维持BTSCs干性的稳定。3、探索Glycogel细胞外基质组分的使用条件,实现小鼠BTSCs的2D和3D传代扩增,并观察传代后的细胞状态。4、借助活死染色试剂盒判断BTSC organoids的生存状态。5、原代BTSCs扩增的p KM成分,包括4种生长因子和6种小分子化合物,包括:EGF、R-Spindin1(RSPO1)、Noggin、Wnt3a、Bix01294、Bay K8644、RG108、SB431542、A83-01、Forskolin,这里简命名为10P(p KM)。按照涉及信号通路进行分组,通过类器官的形成效率和数量对10P进行评价,探索对于BTSCs扩增重要的细胞因子/小分子化合物。6、通过转录组测序结果分析研究3D Glycogel较2D Glgluteus mediusycogel促进BTSCs扩增的原因。7、利用硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶(HS3ST1)等研究3-O-硫酸乙酰肝素对BTSCs干性维持和体外扩增的作用机制。结果1、分离得到的小鼠原代BTSCs在KM培养基中呈克隆生长,表达BTSCs特异性基因Ep CAM、SOX17、PDX1,且免疫组化染色表达Ep CAM、CK19。第21天进行流式分析显示培养的细胞中Ep CAM+比例约为为84%±10.6%。第14天进行细胞计数,每只小鼠约获得2×104个目的细胞。2、分离得到的小鼠原代BTSCs在10p KM扩增培养基中快速扩增,第7天进行细胞计数可获得4.2×105个目的细胞,细胞数量大大增加。细胞形态呈上皮样细胞贴壁生长,核质比较高,同样表达胆管树干细胞特异性基因Ep CAM、SOX17、PDX1,且免疫组化染色表达Ep CAM+、CK19+。第7天进行流式分析显示培养的细胞中Ep CAM+比例约为82%±6.3%。3、对扩增培养基中的10P进行评价,发现RG108、A83-01、Forskolin、Bay K8644、RSPO1对于BTSCs的扩增和干性维持极其重要,并确定5p KM为最终使用的扩增培养基。4、传代时使用Matrigel包埋法形成囊状类器官可实现快速传代扩增,这种3D类器官传代扩增的方法至少可传代6代,可实现3×107细胞的获得。且通过转录组测序验证BTSCs特异性表达基因表达维持稳定。5、对于细胞外基质成分的研究发现,在不使用Matrigel的情况下,单独使用透明质酸水凝胶不足以支持BTSCs的体外扩增和维持,但是添加硫酸乙酰肝素和透明质酸的水凝胶,可以促进BTSCs的附着,实现BTSCs的传代扩增。6、生信数据表明在BTSCs体内3-O修饰硫酸乙酰肝素的酶(HS3ST1、HS3ST3A)表达。通过q PCR实验验证,其中HS3ST1的表达结果与生信结果一致。结论1、通过KM培养基培养可获得小鼠BTSCs克隆,且其中目的细胞比例为84%±10.58%。2、通过生长因子和小分子化合物(10p)构成的BTSCs扩增培养基10p KM,可有效扩增原代BTSCs,获得大量细胞且维持干性稳定。3、通过逐步筛选确定对BTSCs的干性维持和体外增殖有关键作用的5p KM。4、筛选获得了适合BTSCs体外扩增的Glycogel成分。建立了基于Glycogel体系BTSCs的二维和三维的传代扩增方法。通过基于Matrigel的Glycogel体系能够获得BTSC organoids,可至少传代6代。5、在透明质酸水凝胶加硫酸乙酰肝素(HAHS)的Glycogel中,硫酸乙酰肝素是HAHS中支持BTSCs体外增殖的关键。6、HS3ST1在BTSCs高表达,确定3-O-硫酸乙酰肝素是硫酸乙酰肝素中支持BTSCs体外增殖的关键亚型。综上,我们通过小鼠BTSCs建立了一种Glycogel体系,并且提供了胆管树干细胞2D和3D的两种培养方法,且通过3D类器官培养能够实现稳定传代扩增,这为将来人的BTSCs的扩增提供参考和借鉴。本课题将解决BTSCs临床应用数量不足的问题,为胆管树干细胞应用于临床创造条件。