酒精性肝损伤是一个关键的社会公共卫生问题,目前的治疗药物大多有严重不良反应,因此开发干预酒精性肝损伤的天然来源功能性食品RepSox化学结构日益受到关注。松花粉是我国传统的药食同源食品原料,被证实具有抗化学性肝损伤等多种功效,但其抗酒精性肝损伤的功能鲜有报道。相比于醇提物,水提物具有可直接作为普通食品原料使用的优势。然而,黄酮和酚类等小分子活性成分在松花粉中大多以结合态存在或因为水溶性差而导致其在水提物中含量较低,水提物功能有限。本文以松花粉水提物(Pine pollen water extract,PPE)为研究对象,分析了其中的主要功能成分,结合文献、网络药理学和细胞模型探讨了其抗酒精性肝损伤功效。使用超滤对PPE进行分级并比较了不同分子量组分的护肝效果进而确定了酶解筛选指标,再采用酶法对松花粉进行辅助水提,INCB28060体内实验剂量评估了酶法对PPE护肝功效的提升效果。主要研究内容和结果如下:首先,结合课题组前期研究,对PPE中的基本成分进行补充分析,发现PPE的总糖含量为39.57%±1.67%;粗多糖含量为12.25%±0.33%;总蛋白质含量为12.11%±0.07%;总酚含量为5.36±0.02 mg GAEUrologic oncology/g PPE;总黄酮含量为1.95±0.15 mg TE/g PPE。通过UPLC-QTOF-MS鉴定出8种小分子活性成分:4-O-葡萄糖苯甲酸、原儿茶酸、香草酸、6-羟基犬尿喹啉酸、水杨酸、香豆酰奎宁酸、咖啡酸和对香豆酸。通过网络药理学分析推断出松花粉中小分子活性成分发挥抗酒精肝损伤主要涉及的通路为PI3K-AKT信号通路、化学致癌-受体激活、脂质与动脉粥样硬化、化学致癌-活性氧、Ras信号通路、MAPK信号通路等。同时结合文献对多糖、蛋白、肽等的护肝机制研究进行归纳总结,认为松花粉的抗酒精肝损伤可能的关键机制为改善由活性氧(Reactive oxygen species,ROS)过量产生等引起的氧化应激和凋亡,且可能与上游通路MAPK和PI3K/AKT相关。然后,建立乙醇诱导HepG2细胞损伤模型,探究PPE的护肝功效和机制。结果发现,PPE可以显著降低细胞LDH泄露率,改善细胞形态,显示出对乙醇诱导细胞损伤的保护作用。同时,PPE可以通过降低ROS和MDA含量同时提升GSH和SOD的水平,显著改善乙醇诱导的细胞氧化应激。RT-PCR和Western Blot结果表明,PPE可以显著提升氧化应激基因和蛋白(Nrf2、HO-1和Keap1)的表达水平;显著降低凋亡蛋白Bax表达和Caspase3的活化。PPE显著改善了乙醇诱导HepG2细胞中AKT和MAPK(p38/JNK/ERK)的磷酸化水平,同时使用抑制剂验证了PPE改善细胞氧化应激和凋亡的途径与MAPK相关。接着,在确定了PPE具有抗酒精肝损伤功效的基础上,使用超滤对PPE进行分级,比较相对分子量<1000、1000～5000、5000～10000、10000～100000和>100000五个组分的总糖、总蛋白的含量,发现糖主要集中在相对分子量>10000的组分,蛋白/肽类主要集中在相对分子量1000～10000的组分,黄酮、多酚等小分子主要集中在<1000的组分。比较了五种组分的抗氧化性及保护HepG2细胞损伤水平差异,结果表明,五种组分的体外抗氧化活性具有显著差异,分子量越小抗氧化活性越强。从ALT、AST、LDH、SOD和GSH水平可以看出五种组分都具有肝保护效果,具体效果差异不显著,说明PPE中的几种组分均可发挥护肝功效,因此酶解辅助水提实验中将考虑同步检测产物中多酚、黄酮以及总糖的含量及产物的分子量分布。最后,使用酶解辅助松花粉进行水提,旨在提升PPE活性物质的溶出率和护肝活性。采用蛋白酶(酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶)、纤维素酶、果胶酶和α-淀粉酶对松花粉进行酶解辅助水提,结果表明,六种酶均能显著提升冻干粉得率、总酚、总糖和总抗氧化性的水平。三种蛋白酶和α-淀粉酶对总酚和总抗氧化性提升的贡献较大,在高酶量条件下,酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶辅助提取后的总酚含量分别提升了37.36%、57.24%、31.11%和36.07%;六种酶对总糖含量提升都有一定贡献,在高酶量条件下,果胶酶、纤维素酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶辅助提取后的总糖含量分别提升了95.11%、116.35%、46.91%、61.72%、94.60%和201.45%。碱性蛋白酶显著改变了水提物的分子量分布,在高酶量条件下,相对分子量≤1450的组分含量由33.50%提升至37.63%,≥5000的组分含量由19.90%降低至8.27%。结合以上结果采用碱性蛋白酶酶解前后的水提物进行护肝功效比较,与未酶解组相比,酶解组提取物抗氧化应激和凋亡的基因、蛋白表达水平显著高于未酶解组,促凋亡的基因与蛋白表达水平显著低于未酶解组,因此酶解在一定程度上可以提升PPE的护肝功效。