松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)作为一种世界性检疫害虫,严重危害松属植物,自1982年发现于我国南京中山陵,对我国森林生态系统影响巨大,造成不可估量的经济损失。根据国家林业与草原局最新公告,目前该病已在我国19个省(市、自治区)发生,随着松材线虫不断进化,“西进北扩”的趋势也愈发严重。因此,对松材线虫病致病机理的研究刻不容缓。考虑到其病害系统复杂,还有人为因素的参与,导致多年以来,松材线虫致病机理一直存在争议。根据研究室前期的实验结果,在松材线虫的致病过程中会分泌一种与其致病密切相关的类甜蛋白“BxTLP1”,通过免疫组化组织定位及酵母双杂交筛选与寄主马尾松的互作蛋白,以期从分子、细胞层面解析关键致病因子Bxtlp1在致病过程中的分子作用机制;并通过微生物组学、代谢组学、转录组学技术研究了松材线虫入侵马尾松后,树体内微生物群落的变化、关键代谢物的筛选和早期入侵后马尾松基因组整体的转录情况。主要结果如下:(1)根据松材线虫分泌蛋白组分析和前期研究基础筛选出松材线虫致病松树过程中的重要分泌蛋白TLPs。q RT-PCR定量结果表明,Bxtlp1,Bxtlp7和Bxtlp8基因在不同虫态下的表达量差异明显。Bxtlp1在二龄幼虫(L2)表达量达到峰值,而Bxtlp7和Bxtlp8在三龄幼虫(L3)表达量达到峰值;通过原核表达体系表达得松材线虫BxTLP1蛋白不具有β-1,3-葡聚糖酶活性,BxTLP7蛋白和BxTLP8蛋白具有β-1,3-葡聚糖酶活性;通过调整优化线虫干扰体系,采用双链RNA干扰的方法分别将松材线虫体内的Bxtlp1,Bxtlp7和Bxtlp8基因沉默。结果显示,最佳ds RNA干扰引物是ds TLP1-2、ds TLP7-3、ds TLP8-1;最佳干扰时间是36 h;松材线虫的虫态对于干扰效率没有显著影响;Bxtlp1和Bxtlp7基因被干扰后会降低松材线虫的取食速率和繁殖率;对于Bxtlp8进行RNA干扰,不会影响松材线虫的繁殖和取食;在本氏烟草中瞬时表达Bxtlp1,Bxtlp7和Bxtlp8,发现Bxtlp1定位于细胞膜和细胞核,而Bxtlp7和Bxtlp8只观察到定位细胞核。在松材线虫在侵染过程中,从定位的情况来推测BxtRSL3lp1更有潜力与马尾松发生互作联系;免疫组化试验证明,松材线虫Bxtlp1定位虫体的食道腺Impoverishment by medical expenses和肠道,说明BxTLP1蛋白可以被分泌至松材线虫体外;(2)通过对马尾松转录组学数据的分析,我们筛选出早期马尾松响应松材线虫的最核心基因模块“MEmagenta”,该模块中的基因在氧化磷酸化、氨基糖和核苷酸糖代谢、植物MAPK信号通路中高度富集;(3)采用酵母双杂交膜蛋白体系,从松selleck NMR材线虫侵染马尾松的酵母文库中筛选BxTLP1的靶标互作蛋白,诱饵蛋白自激活试验证明BxTLP1没有自激活现象。在30个候选靶标基因中筛选8个阳性克隆进行酵母一对一验证,明确在酵母中的互作结果。进行免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co IP)实验发现8个阳性克隆中只有4个靶标基因可以和BxTLP1相互作用,分别是p MS-3(含有RPN7/PCI结构域的26S蛋白酶体)、p MS-6(包含Ribosomal L40e超家族的蛋白)、p MS-7(Ubiquitin-like泛素蛋白酶)、p MS-26(超氧化物歧化酶)。(4)使用LEf Se(Linear discriminant analysis Effect Size,线性判别分析)对枯萎松树和健康松树进行比较分析,以确定健康和枯萎松体内差异的主要群落。结果表明,在枯萎的松树中,放线菌和类杆菌是细菌群落的差异标志群落,而在健康的松树中,变形菌门(Proteobacteria)门中的根瘤菌目(Rhizobiales)是主要的细菌群落(图6-3B)。同时,健康松树中真菌群落的差异标记是马拉色菌目(Malasseziales),银耳目(Tremellales),粪壳菌目(Sordariales)和镰刀菌属(Fusarium),而假球壳科(Pleosporaceae)是枯萎松中的关键真菌群落;(5)利用基于LC-MS/MS的代谢组学来了解松材线虫在发病过程中寄主代谢产物的差异。共鉴定了307种差异代谢物,其中246种代谢物显著上调,61种代谢物显著下调。通过KEGG富集分析和差异代谢物注释分析,发现聚乙烯代谢物在枯萎的松树中显著积累。分析相对含量后,发现共有12种核心代谢物,其中包括10种黄酮类代谢物和2种芳香族聚酮化合物代谢物;综上所述,通过建立马尾松与松材线虫互作的酵母双杂交文库,筛选得到靶标蛋白4个,推测松材线虫关键致病因子Bxtlp1,可能通过介导寄主细胞的泛素化调节、氧化应激、MAPK分子信号转导通路去影响寄主的免疫防御过程,从而加剧病情;松材线虫入侵寄主体内对微生物群落变化的影响,可能导致分泌毒素的群落富集,从而对寄主细胞造成伤害;松材线虫的入侵造成寄主体内的聚乙烯代谢物显著富集,主要集中在黄酮类代谢物,这些物质的过量积累可能对寄主细胞发生毒害,从而影响寄主的防御反应。这些工作帮助加深了对松材线虫致病机理的研究,为松材线虫病疫情防控技术产出提供理论依据。