小麦是世界约三分之一人口的主粮,是主要的粮食作物。然而,小麦常受到多种病害的威胁,其中,小麦条锈病(Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst)是危害最重的病害之一。利用抗性品种是绿色防控条锈病的根本措施。然而,生产上抗性品种丧失导致病害不断流行成灾,是小麦条锈病防控的重大生产难题。因而,培育持久抗病品种是亟待解决的问题。小麦条锈病为专化型活体营养寄生真菌,主要通过吸器分泌大量毒性效应子调控寄主免疫,从寄主吸收Polyhydroxybutyrate biopolymer营养,达到侵染致病。因而,该论文拟在前期鉴定出一些重要效应子的基础上,深入解析条锈菌效应子调控寄主免疫的机制,探索通过阻止病菌效应子操纵寄主免疫,创制广谱抗病材料,为小麦抗病品种培育提供资源。前期基于条锈菌吸器转录组和功能筛选,获得了在吸器中高丰度诱导表达且能显著抑制小麦基础免疫反应的效应子Pst＿215。在此基础上,拟深入研究效应子Pst＿215的调控机理,主要研究结果如下:1.利用YSST(yeast secretion signal AZD1152-HQPAtrap)系统证明Pst＿215的N-端1-18位氨基酸编码的信号肽具有分泌功能;q RT-PCR分析发现Pst＿215在条锈菌侵染小麦的12和24 hpi(hour post inoculation)高诱导表达,推测其在条锈菌侵染的早期发挥作用;在烟草中瞬时表达Pst＿215抑制flg22诱导的胼胝质积累及MAPK磷酸化,并导致Nb PR1、Nb PR2和Nb WRKY12表达降低,表明Pst＿215具有抑制植物PTI(PAMP triggered immunity)功能。2.利用农杆菌介导的小麦遗传转化体系创制了稳定过表达和沉默Pst＿215的小麦转基因。接种CYR23,野生型小麦出现明显坏死反应,Pst＿215-OE植株在产生过敏性坏死反应的同时产生少量的夏孢子堆;与野生型相比,Pst＿215-OE植株中条锈菌侵染点周围活性氧产生面积减少,Ta PR1和Ta PR2表达下降,条锈菌菌丝长度与侵染面积均增加,生物量升高,表明在小麦中过表达Pst＿215促进条锈菌侵染。然而Pst＿215-RNAi#L1和#L2植株接种CYR32,与野生型相比,Pst＿215-RNAi植株条锈菌产孢量明显减少,条锈菌菌丝长度和菌丝面积减小,生物量降低,细胞坏死面积增加,Ta PR1和Ta PR2表达升高,表明沉默Pst＿215降低条锈菌的致病力。结果表明,Pst＿215为显著影响条锈菌致病性的重要效应蛋白。3.利用免疫共沉淀与质谱技术筛选Pst＿215的候选靶标,并利用酵母双杂交实验,荧火素酶互补实验和免疫共沉淀实验表明Pst＿215与小麦Ta MKK2互作。CRISPR-Cas9编辑Ta MKK2基因创制Ta MKK2敲除突变体,接种CYR23,敲除Ta MKK2植株产生少量夏孢子,菌丝长度和侵染面积增加。然而,过表达Ta MKK2植株接种CYR32,植株条锈菌产孢量显著减少,条锈菌的生长发育受到抑制,小麦MAPK磷酸化水平增加,活性氧面积增加,Ta PR1、Ta PR2和Ta WRKY53表达量上调。在过表达Ta MKK2植株中瞬时表达Pst＿215则抑制MAPK磷酸化水平,降低防御相关基因表达,削弱Ta MKK2抗病性。结果表明Ta MKK2正调控小麦对条锈菌的抗性,效应子Pst＿215抑制Ta MKK2对条锈菌的抗性。4.本研究利用IP-MS筛选Ta MKK2的互作靶标,并通过酵母双杂交,萤光素酶互补实验和Co-IP实验表明Ta MKK2与Ta MAPK4/6互作。利用病毒诱导的基因沉默技术沉默Ta MAPK6,沉默Ta MAPK6植株条锈菌产孢量与生物量增加,活性氧面积减少,表明沉默Ta MAPK6降低小麦对条锈菌的抗性。体外磷酸化实验结果显示:Ta MKK2磷酸化Ta MAPK4/6,而Pst＿215能够抑制Ta MKK2对Ta MAPK4/6的磷酸化,且随着Pst＿215蛋白量增加Ta MAPK4/6磷酸化条带减弱。ITC实验表明Pst＿215与Ta MKK2的结合亲和力高于Ta MKK2与Ta MAPK4/6的结合亲和力,且Pull-down实验表明随着Pst＿215蛋白量的增加Ta MKK2与Ta MAPK4/6互作减少。5.利用酵母双杂交实验、荧火素酶互补实验及免疫共沉淀实验表明Ta MAPK6与Ta SGT1互作,Ta MKK2和Ta MAPK4diABZI STING agonist molecular weight不能与Ta SGT1互作。体外磷酸化实验表明Ta MAPK6磷酸化Ta SGT1,S290和S365是Ta SGT1的关键磷酸化位点,突变后不能被Ta MAPK6磷酸化。对Ta SGT1过表达植株和基因敲除突变体进行抗病性鉴定发现,Ta SGT1-OE植株接种CYR32孢子堆数量减少,活性氧面积和细胞坏死面积显著增加;Ta SGT1敲除突变体植株接种CYR23,产生了少量夏孢子,条锈菌的生物量与侵染面积显著增加,表明Ta SGT1正调控小麦对条锈菌的抗性。在烟草中瞬时表达Ta SGT1~(S290DS365D)(磷酸化激活)显示Ta SGT1蛋白在细胞核中积累的比例增加,在Ta SGT1基因敲除突变体中瞬时表达Ta SGT1~(S290AS365A)(磷酸化失活)和Ta SGT1~(S290DS365D),发现Ta SGT1~(S290AS365A)表达的Ta SGT1-KO植株接种CYR23产生少量夏孢子,而Ta SGT1~(S290DS365D)瞬时表达则产生明显过敏性坏死,防卫相关基因表达升高,表明Ta SGT1模拟磷酸化增强其在细胞核中的累积和小麦对条锈菌的抗性。进一步研究发现,过表达Ta SGT1植株接种CYR23细胞核Ta SGT1量较未接菌植株增加,表明抗病反应中Ta SGT1在细胞核的量增多。在过表达Ta SGT1植株中瞬时表达Pst＿215则降低细胞核中Ta SGT1蛋白水平,削弱小麦抗性。在Ta SGT基因敲除突变体中瞬时表达含有核定位信号的Ta SGT1,产生过敏性坏死,瞬时表达含有核输出信号的Ta SGT1植株,抗病性有所增强,但有少量夏孢子堆产生,表明Ta SGT1细胞核定位增强小麦对条锈病抗性。综上所述,通过对Pst＿215的功能和作用机理的解析,揭示了Pst＿215作为条锈菌重要的毒性因子,作用于小麦Ta MKK2-Ta MAPK6-Ta SGT1磷酸化级联途径,调节Ta SGT1在细胞核与细胞质的分布,从而抑制小麦对条锈病的抗性,丰富了对条锈菌调控植物免疫的认识。研究中,通过RNAi、CRISPPR-Cas9、过表达等技术创制了效应子Pst＿215及Ta MKK2-Ta MAPK6-Ta SGT1级联途径成员的转基因材料,为持久广谱抗病小麦材料创制提供了基因资源与材料。