骨肉瘤(Osteosarcoma,OS),是最常见的原发恶性骨肿瘤之一,好发于青少年,恶性程度高,容易早期发生肺转移。骨肉瘤目前的治疗方式主要为外科手术联合围手术期化疗。人工关节重建技术的进步,以及化疗方案的改进和完善,使骨肉瘤患者的保肢率和生存率都得到了显著改善。但是对于出现复发、转移的骨肉瘤,预后仍然很差,5年生存率只有大约20%。在治疗过程中出现化疗药物耐药,以及在根治性手术中存在术区肿瘤残留,可能与骨肉瘤的复发、转移、不良预后密切相关。乏氧是肿瘤微环境的特点之一。由于肿瘤的生长速度超过了供氧血管的生长速度,大多数实体肿瘤内部都会出现乏氧现象。乏氧微环境,已被证实是引起包括骨肉瘤在内的多种实体肿瘤恶性程度增加、转selleckchem SB203580移能力增强,以及药物耐药的因素之一,与肿瘤进展、转移和不良预后密切相关。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是重要的乏氧标记物,常常在乏氧细胞中高表达。HIF-1α已被证实能通过促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,提高肿瘤细胞在乏氧环境中的生存能力。乏氧激活前药替拉扎明(Tirapazamine,TPZ)在乏氧细胞内代谢后,能产生可以与DNA结合的自由基,导致细胞的DNA损害和死亡。但替拉扎明对常氧环境中的细胞毒性有限。替拉扎明还被发现可以增强多柔比星、顺铂等化疗药物的作用。替拉扎明用于骨肉瘤治疗的研究,在2021年才见报道,现有文献很少。目前对于替拉扎明对骨肉瘤的作用及相关机制有很大的研究前景。此外,在骨肉瘤等恶性骨肿瘤的根治性手术中,由于肿瘤常常毗邻重要血管、神经,以及需要兼顾保留软组织和获取足够切缘之间的平衡,需要一个有效的方法灭活创面内潜在的残余肿瘤,以降低肿瘤复发的风险。根据骨肉瘤等恶性骨肿瘤的临床特点和治疗需求,开发替拉扎明局部应用等新使用方式,可能是目前替拉扎明等乏氧激活前药值得探索的方向。本研究旨在利用体外和体内实验探讨乏氧对骨肉瘤的影响,阐述替拉扎明对常氧和乏氧骨肉瘤细胞的效应及作用机制,展示替拉扎明局部应用对骨肉瘤的治疗效果。第一部分:乏氧骨肉瘤细胞增殖与侵袭的动物研究研究目的和意义:目前尚未见在动物模型中对比乏氧环境中存活的骨肉瘤细胞与常氧环境培养的骨肉瘤细胞差异的报道。本部分拟利用动物植瘤实验,对比乏氧和常氧骨肉瘤细胞所形成的实体骨肉瘤在增殖、侵袭等相关蛋白表达方面的差异。研究方法:培养了能在乏氧环境中稳定生长的HOS骨肉瘤细胞。将12只裸鼠平均分为常氧组和乏氧组。常氧组裸鼠皮下植入常氧环境中培养的HOS骨肉瘤细胞。乏氧组裸鼠皮下植入经乏氧环境处理的HOS骨肉瘤细胞。绘制两组裸鼠皮下骨肉瘤的生长曲线。处死裸鼠后,称量两组肿瘤的质量。使用蛋白质免疫印迹,比较两组肿瘤组织内Ki-67、MMP2、HIF-1α表达的差异。结果:与常氧组相比,乏氧组裸鼠皮下的肿瘤生长更快,质量更高。乏氧组的实体骨肉瘤Ki-67和MMP2蛋白表达更高。两组实体骨肉瘤中的HIF-1α表达未发现差异。结论:乏氧环境中存活的骨肉瘤细胞所形成的实体骨肉瘤,具有更强的增殖能力和侵袭潜力。实体骨肉瘤内的HIF-1α表达程度可能不能完全反映实体肿瘤的增殖、侵袭能力。第二部分:乏氧和替拉扎明对骨肉瘤细胞的效应及机制研究研究目的和意义:本部分拟探索乏氧、替拉扎明,以及两者的交互作用对骨肉瘤细胞的影响。这是目前相对全面的替拉扎明对骨肉瘤的效应及机制的研究。本研究还发现,替拉扎明会引起骨肉瘤细胞HIF-1α表达和Akt磷酸化改变。此前没有替拉扎明引起Akt细胞通路改变的报道。研究方法:选择HOS和K7M2-WT骨肉瘤细胞系,分别利用MTT实验、Ed U实验、Transwell实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验、蛋白质免疫印迹等方法,探索乏氧环境和替拉扎明对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、细胞周期、细胞通路、HIF-1α表达等方面的改变。结果:乏氧环境中存活的骨肉瘤细胞,具有更强的增殖、迁移、侵袭能力,更高的HIF-1α表达和Akt磷酸化程度。乏氧使得更大比例的骨肉瘤细胞处于S期。在乏氧环境中,替拉扎明抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进凋亡,降低S期Puromycin细胞占比,下调HIF-1α表达和Akt磷酸化。乏氧和替拉扎明之间存在交互作用。替拉扎明存在的乏氧环境中,增强Akt磷酸化能够提高骨肉瘤的细胞活力和侵袭能力。在常氧环境中,替拉扎明对骨肉瘤细胞的毒性较低。实验所用浓度的替拉扎明在常氧环境中促进了骨肉瘤细胞的HIF-1α表达。结论:乏氧环境中存活的骨肉瘤细胞,恶性程度更高。替拉扎明能够一定程度上逆转乏氧对骨肉瘤细胞的影响。Akt通路参与了乏氧和替拉扎明对骨肉瘤细胞的作用。第三部分:替拉扎明局部应用于Biofouling layer实体乏氧骨肉瘤的探索研究目的和意义:本部分拟探索替拉扎明瘤内注射对骨肉瘤的影响。据我们所知,此前没有替拉扎明局部应用于实体骨肉瘤的研究。替拉扎明的局部应用似乎更贴近骨肉瘤手术的临床需求,在临床实践中也更有可行性。研究方法:将乏氧环境中稳定生长的HOS骨肉瘤细胞植入12只裸鼠皮下。将裸鼠平均分为TPZ组和DMSO组。待皮下肿瘤体积约90～110 mm~3时,分别向裸鼠肿瘤内注射替拉扎明溶液(TPZ组)或DMSO溶液(DMSO组,具有和替拉扎明溶液相同的DMSO浓度)。首次瘤内注射药物后第5天,处死裸鼠。比较两组裸鼠骨肉瘤体积、质量的差异。比较两组肿瘤HE染色切片的差异。使用蛋白质免疫印迹,比较两组肿瘤组织Cleaved-caspase 3、Ki-67、HIF-1α表达的差异。结果:TPZ组骨肉瘤体积和质量低于DMSO组。相比于DMSO组,TPZ组骨肉瘤的HE染色切片内有更多的坏死区域。TPZ组肿瘤组织内Cleaved-caspase 3表达增加,Ki-67和HIF-1α表达减少。结论:替拉扎明局部应用于实体乏氧骨肉瘤,能够抑制肿瘤的生长,促进肿瘤的凋亡和坏死,引起肿瘤内HIF-1α表达降低。